Имуномодулаторните метаболити се клучна карактеристика на туморската микросредина (TME), но со неколку исклучоци, нивните идентитети остануваат во голема мера непознати. Овде, ги анализиравме туморите и Т-клетките од туморите и асцитите на пациенти со серозен карцином од висок степен (HGSC) за да го откриеме метаболомот на овие различни TME оддели. Асцитите и туморските клетки имаат големи разлики во метаболитите. Во споредба со асцитите, тумор-инфилтрирачките Т-клетки се значително збогатени со 1-метилникотинамид (MNA). Иако нивото на MNA во Т-клетките е покачено, експресијата на никотинамид N-метилтрансфераза (ензим кој го катализира трансферот на метил групи од S-аденозилметионин во никотинамид) е ограничена на фибробласти и туморски клетки. Функционално, MNA ги индуцира Т-клетките да го лачат цитокинот алфа, факторот на туморска некроза, кој го промовира туморот. Затоа, MNA добиена од TME придонесува за имунолошката регулација на Т-клетките и претставува потенцијална имунотерапевтска цел за третман на рак кај луѓето.
Метаболитите добиени од тумор можат да имаат длабок инхибиторен ефект врз антитуморскиот имунитет, а сè повеќе докази покажуваат дека тие можат да послужат и како клучна движечка сила за прогресија на болеста (1). Покрај Варбурговиот ефект, неодамнешната работа започна да ја карактеризира метаболичката состојба на туморските клетки и нејзината врска со имунолошката состојба на микросредината на туморот (TME). Студиите на глувчешки модели и човечки Т-клетки покажаа дека метаболизмот на глутамин (2), оксидативниот метаболизам (3) и метаболизмот на гликоза (4) можат да дејствуваат независно врз различни подгрупи на имунолошки клетки. Неколку метаболити во овие патишта ја инхибираат антитуморската функција на Т-клетките. Докажано е дека блокадата на коензимот тетрахидробиоптерин (BH4) може да ја оштети пролиферацијата на Т-клетките, а зголемувањето на BH4 во телото може да го подобри антитуморскиот имунолошки одговор посредуван од CD4 и CD8. Покрај тоа, имуносупресивниот ефект на кинуренин може да се спаси со администрација на BH4 (5). Кај глиобластом мутант на изоцитрат дехидрогеназа (IDH), секрецијата на енантиометаболичен (R)-2-хидроксиглутарат (R-2-HG) ја инхибира активацијата, пролиферацијата и цитолизата на Т-клетките (6). Неодамна, е покажано дека метилглиоксал, нуспроизвод на гликолизата, се произведува од супресорни клетки од миелоидно потекло, а трансферот на метилглиоксал во Т-клетките може да ја инхибира функцијата на ефекторните Т-клетки. Во третманот, неутрализацијата на метилглиоксалот може да ја надмине активноста на супресорските клетки добиени од миелоид (MDSC) и синергистички да ја подобри терапијата со блокада на контролни точки кај модели на глувци (7). Овие студии заедно ја нагласуваат клучната улога на метаболитите добиени од TME во регулирањето на функцијата и активноста на Т-клетките.
Дисфункцијата на Т-клетките е широко пријавувана кај ракот на јајниците (8). Ова делумно се должи на метаболичките карактеристики својствени за хипоксија и абнормална васкулатура на туморот (9), што резултира со претворање на гликоза и триптофан во нуспроизводи како што се млечна киселина и кинуренин. Прекумерниот екстрацелуларен лактат го намалува производството на интерферон-γ (IFN-γ) и ја поттикнува диференцијацијата на миелосупресивните подгрупи (10, 11). Консумирањето на триптофан директно ја инхибира пролиферацијата на Т-клетките и ја инхибира сигнализацијата на рецепторот на Т-клетките (12-14). И покрај овие набљудувања, многу работа околу имунолошкиот метаболизам е извршена во ин витро култура на Т-клетки користејќи оптимизирани медиуми или ограничена на хомологни модели на глувци ин виво, од кои ниту едното не ја одразува целосно хетерогеноста на човечките карциноми и физиолошката макро и микро средина.
Заедничка карактеристика на ракот на јајниците е перитонеалното ширење и појавата на асцит. Акумулацијата на клеточна течност кај асцитот е поврзана со напредна болест и лоша прогноза (15). Според извештаите, овој уникатен компартмент е хипоксичен, има високи нивоа на васкуларен ендотелијален фактор на раст (VEGF) и индолеамин 2,3-диоксигеназа (IDO) и е инфилтриран од Т-регулаторни клетки и миелоидни инхибиторни клетки (15-18). Метаболичката средина на асцитот може да биде различна од онаа на самиот тумор, па затоа репрограмирањето на Т-клетките во перитонеалниот простор е нејасно. Покрај тоа, клучните разлики и хетерогеноста помеѓу асцитот и метаболитите присутни во туморската средина може да ја попречат инфилтрацијата на имуните клетки и нивната функција врз туморите, и потребни се понатамошни истражувања.
За да ги решиме овие проблеми, дизајниравме метод на чувствителна клеточна сепарација и течна хроматографија - тандем масена спектрометрија (LC-MS/MS) за проучување на различни типови клетки (вклучувајќи CD4 + и CD8 + Т-клетки), како и во рамките на и помеѓу туморите. Неговите метаболити се протегаат низ клетките во истата асцитна и туморска средина на пациентот. Го користиме овој метод во комбинација со високодимензионална проточна цитометрија и секвенционирање на РНК во единечни клетки (scRNA-seq) за да обезбедиме високо решен портрет на метаболичкиот статус на овие клучни популации. Овој метод откри значително зголемување на нивото на 1-метилникотинамид (MNA) во туморските Т-клетки, а експериментите in vitro покажаа дека имуномодулаторниот ефект на MNA врз функцијата на Т-клетките претходно беше непознат. Општо земено, овој метод ги открива меѓусебните метаболички интеракции помеѓу туморите и имуните клетки и дава единствени увиди во метаболитите на имунолошката регулација, што може да биде корисно за третман на имунотерапија за рак на јајници базирана на Т-клетки. Можности за третман.
Користевме високодимензионална проточна цитометрија за истовремено квантифицирање на внесувањето на гликоза [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-деоксиглукоза (2-NBDG) и митохондријалната активност [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) се типични маркери еден до друг што ги разликуваат имунолошките клетки и популациите на туморски клетки (Табела S2 и Слика S1A). Оваа анализа покажа дека во споредба со Т-клетките, асцитите и туморските клетки имаат повисоки нивоа на внесување на гликоза, но имаат помали разлики во митохондријалната активност. Просечното внесување на гликоза од туморските клетки [CD45-EpCAM (EpCAM)+] е три до четири пати поголемо од Т-клетките, а просечното внесување на гликоза од CD4 + Т-клетките е 1,2 пати поголемо од CD8 + Т-клетките, што укажува дека туморските инфилтрирачки лимфоцити (TIL) имаат различни метаболички барања дури и во истиот TME (Слика 1A). Спротивно на тоа, митохондријалната активност кај туморските клетки е слична на онаа на CD4 + Т-клетките, а митохондријалната активност на двата типа клетки е поголема од онаа на CD8 + Т-клетките (Слика 1Б). Општо земено, овие резултати го откриваат метаболичкото ниво. Метаболичката активност на туморските клетки е поголема од онаа на CD4 + Т-клетките, а метаболичката активност на CD4 + Т-клетките е поголема од онаа на CD8 + Т-клетките. И покрај овие ефекти кај различните типови клетки, не постои конзистентна разлика во метаболичкиот статус на CD4 + и CD8 + Т-клетките или нивните релативни пропорции кај асцитите во споредба со туморите (Слика 1В). Спротивно на тоа, во фракцијата на CD45-клетки, пропорцијата на EpCAM+ клетки во туморот се зголеми во споредба со асцитите (Слика 1Д). Исто така, забележавме јасна метаболичка разлика помеѓу компонентите на клетките EpCAM+ и EpCAM-. EpCAM+ (туморски) клетките имаат поголемо внесување на гликоза и митохондријална активност од EpCAM- клетките, што е многу повисоко од метаболичката активност на фибробластите во туморските клетки во TME (Слика 1, Е и F).
(A и B) Среден интензитет на флуоресценција (MFI) на апсорпција на гликоза (2-NBDG) (A) и митохондријална активност на CD4 + Т-клетките (MitoTracker темно црвена) (B) Репрезентативни графикони (лево) и табелирани податоци (десно), CD8 + Т-клетки и EpCAM + CD45-туморски клетки од асцит и тумор. (C) Односот на CD4 + и CD8 + клетки (од CD3 + Т-клетки) кај асцит и тумор. (D) Пропорција на EpCAM + туморски клетки кај асцит и тумор (CD45−). (E и F) EpCAM + CD45-туморски и EpCAM-CD45-матрична апсорпција на гликоза (2-NBDG) (E) и митохондријална активност (MitoTracker темно црвена) (F) репрезентативни графикони (лево) и табелирани податоци (десно) Асцити и туморски клетки. (G) Репрезентативни графикони на експресија на CD25, CD137 и PD1 со проточна цитометрија. (H и I) експресија на CD25, CD137 и PD1 на CD4 + Т-клетки (H) и CD8 + Т-клетки (I). (J и K) Наивни, фенотипови на централна меморија (Tcm), ефекторни (Teff) и ефекторни мемории (Tem) базирани на експресијата на CCR7 и CD45RO. Репрезентативни слики (лево) и табеларни податоци (десно) на CD4 + Т-клетки (J) и CD8 + Т-клетки (K) кај асцити и тумори. P вредности одредени со спарен t-тест (*P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). Линијата ги претставува совпаднатите пациенти (n = 6). FMO, флуоресценција минус еден; MFI, медијански интензитет на флуоресценција.
Понатамошната анализа откри други значајни разлики помеѓу високорешениот фенотипски статус на Т-клетките. Активираната (Слика 1, G до I) и ефекторната меморија (Слика 1, J и K) кај туморите се многу почести од асцитот (пропорција на CD3 + Т-клетки). Слично на тоа, анализата на фенотипот преку експресија на маркери за активирање (CD25 и CD137) и маркери за осиромашување [програмиран протеин на клеточна смрт 1 (PD1)] покажа дека иако метаболичките карактеристики на овие популации се различни (Слика S1, B до E), не се забележани значајни метаболички разлики помеѓу наивните, ефекторните или мемориските подгрупи (Слика S1, F до I). Овие резултати беа потврдени со користење на методи на машинско учење за автоматско доделување на клеточни фенотипови (21), што дополнително откри присуство на голем број клетки од коскената срцевина (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) во асцитот на пациентот (Слика S2A). Меѓу сите идентификувани типови на клетки, оваа популација на миелоидни клетки покажа највисока апсорпција на гликоза и митохондријална активност (Слика S2, од B до G). Овие резултати ги истакнуваат силните метаболички разлики помеѓу повеќекратните типови на клетки пронајдени кај асцит и тумори кај пациенти со HGSC.
Главниот предизвик во разбирањето на метабономските карактеристики на TIL е потребата од изолирање на примероци од Т-клетки со доволна чистота, квалитет и квантитет од тумори. Неодамнешните студии покажаа дека методите за сортирање и збогатување со перли базирани на проточна цитометрија може да доведат до промени во профилите на клеточните метаболити (22-24). За да го надминеме овој проблем, го оптимизиравме методот за збогатување со перли за да го изолираме и изолираме TIL од хируршки ресециран рак на јајници кај луѓето пред анализата со LC-MS/MS (видете Материјали и методи; Слика 2А). Со цел да го процениме целокупното влијание на овој протокол врз промените на метаболитите, ги споредивме профилите на метаболитите на Т-клетките активирани од здрави донори по горенаведениот чекор на одвојување на перли со клетки кои не беа одвоени со перли, но останаа на мраз. Оваа анализа за контрола на квалитетот покажа дека постои висока корелација помеѓу овие два услови (r = 0,77), а техничката повторуваност на групата од 86 метаболити има висока повторуваност (Слика 2Б). Затоа, овие методи можат да извршат точна анализа на метаболитите во клетките што се подложени на збогатување на клеточниот тип, со што се обезбедува првата платформа со висока резолуција за идентификување на специфични метаболити во HGSC, со што им се овозможува на луѓето подлабоко разбирање на специфичноста на клетките во Програмата за сексуален метаболизам.
(A) Шематски дијаграм на збогатување со магнетни зрна. Пред анализата со LC-MS/MS, клетките ќе поминат низ три последователни рунди на збогатување со магнетни зрна или ќе останат на мраз. (B) Ефектот на типот на збогатување врз изобилството на метаболити. Просекот од три мерења за секој тип на збогатување ± SE. Сивата линија претставува однос 1:1. Внатрешна корелација (ICC) на повторени мерења прикажани во ознаката на оската. NAD, никотинамид аденин динуклеотид. (C) Шематски дијаграм на работниот тек на анализа на метаболити на пациенти. Асцити или тумори се собираат од пациенти и се криоконзервираат. Мал дел од секој примерок е анализиран со проточна цитометрија, додека преостанатите примероци се подложени на три рунди на збогатување за CD4+, CD8+ и CD45- клетки. Овие клеточни фракции се анализирани со користење на LC-MS/MS. (D) Топлинска мапа на стандардизирана изобилство на метаболити. Дендрограмот го претставува Вардовото групирање на Евклидовите растојанија помеѓу примероците. (E) Анализа на главните компоненти (PCA) на мапата на метаболитите на примерокот, која прикажува три реплики од секој примерок, примероците од истиот пациент се поврзани со линија. (F) PCA на профилот на метаболитите на примерокот условен од пациентот (т.е. користејќи делумна редундантност); типот на примерокот е ограничен од конвексната обвивка. PC1, главна компонента 1; PC2, главна компонента 2.
Потоа, го применивме овој метод на збогатување за да анализираме 99 метаболити во фракциите на CD4 +, CD8 + и CD45-клетки во примарните асцити и тумори на шест пациенти со HGSC (Слика 2C, Слика S3A и Табела S3 и S4). Популацијата од интерес сочинува од 2% до 70% од оригиналниот голем примерок на живи клетки, а процентот на клетки варира значително помеѓу пациентите. По одвојувањето на зрната, збогатената фракција од интерес (CD4+, CD8+ или CD45-) сочинува повеќе од 85% од сите живи клетки во примерокот во просек. Овој метод на збогатување ни овозможува да анализираме популации на клетки од метаболизмот на ткивото на човечки тумор, што е невозможно да се направи од големи примероци. Користејќи го овој протокол, утврдивме дека l-кинуренин и аденозин, овие два добро карактеризирани имуносупресивни метаболити, биле покачени во туморските Т-клетки или туморските клетки (Слика S3, B и C). Затоа, овие резултати ја покажуваат верноста и способноста на нашата технологија за одвојување на клетките и масена спектрометрија да пронајде биолошки важни метаболити во ткивата на пациентите.
Нашата анализа, исто така, откри силна метаболичка сепарација на типовите клетки кај и помеѓу пациентите (Слика 2D и Слика S4A). Особено, во споредба со другите пациенти, пациентот 70 покажа различни метаболички карактеристики (Слика 2E и Слика S4B), што укажува дека може да има значителна метаболичка хетерогеност помеѓу пациентите. Вреди да се напомене дека во споредба со другите пациенти (1,2 до 2 литри; Табела S1), вкупната количина на асцит собран кај пациентот 70 (80 ml) беше помала. Контролата на хетерогеноста меѓу пациентите за време на анализата на главните компоненти (на пример, користејќи анализа на делумна редундантност) покажува конзистентни промени помеѓу типовите клетки, а типовите клетки и/или микросредината се јасно агрегирани според профилот на метаболитите (Слика 2F). Анализата на единечните метаболити ги нагласи овие ефекти и откри значајни разлики помеѓу типовите клетки и микросредината. Вреди да се напомене дека најекстремната разлика што се забележува е MNA, која обично е збогатена со CD45- клетки и со CD4+ и CD8+ клетки кои го инфилтрираат туморот (Слика 3A). За CD4 + клетките, овој ефект е најочигледен, а MNA во CD8 + клетките исто така се чини дека е силно под влијание на околината. Сепак, ова не е важно, бидејќи само кај три од шесте пациенти може да се процени резултатот од туморот CD8+. Покрај MNA, кај различни типови клетки кај асцит и тумори, други метаболити кои се слабо карактеризирани во TIL се исто така различно богати (слики S3 и S4). Затоа, овие податоци откриваат ветувачки сет на имуномодулаторни метаболити за понатамошни истражувања.
(A) Нормализирана содржина на MNA во CD4+, CD8+ и CD45- клетки од асцит и тумор. Графиконот во квадрат ја покажува средната вредност (линија), интерквартилниот опсег (шарка на рамката) и опсегот на податоци, до 1,5 пати од интерквартилниот опсег (мустаќ на рамката). Како што е опишано во Материјали и методи за пациенти, користете ја лимната вредност на пациентот за да ја одредите вредноста P (*P<0,05 и **P<0,01). (B) Шематски дијаграм на метаболизмот на MNA (60). Метаболити: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-хомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ензими (зелена): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуини; NAMPT, никотинамид фосфорибозил трансфераза; AOX1, алдехид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид моно нуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) t-SNE на scRNA-seq на асцит (сива) и тумор (црвена; n = 3 пациенти). (D) Експресија на NNMT во различни клеточни популации идентификувани со употреба на scRNA-seq. (E) Експресија на NNMT и AOX1 во SK-OV-3, човечки ембрионски бубрег (HEK) 293T, Т-клетки и Т-клетки третирани со MNA. Превитканата експресија е прикажана во однос на SK-OV-3. Прикажан е моделот на експресија со SEM (n = 6 здрави донори). Ct вредности поголеми од 35 се сметаат за неоткриени (UD). (F) Експресија на SLC22A1 и SLC22A2 во SK-OV-3, HEK293T, Т-клетки и Т-клетки третирани со 8mM MNA. Превитканата експресија е прикажана во однос на SK-OV-3. Прикажан е моделот на експресија со SEM (n = 6 здрави донори). Ct вредностите поголеми од 35 се сметаат за неоткриени (UD). (G) Содржина на клеточна MNA во активирани здрави Т-клетки од донор по 72 часа инкубација со MNA. Прикажан е моделот на експресија со SEM (n = 4 здрави донори).
MNA се произведува со пренесување на метил групата од S-аденозил-1-метионин (SAM) во никотинамид (NA) од страна на никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; Слика 3B). NNMT е прекумерно експресиран кај различни видови на рак кај луѓето и е поврзан со пролиферација, инвазија и метастази (25-27). За подобро да го разбереме изворот на MNA во Т-клетките во TME, користевме scRNA-seq за да ја карактеризираме експресијата на NNMT низ типовите на клетки во асцитите и туморите на три пациенти со HGSC (Табела S5). Анализата на приближно 6.500 клетки покажа дека во асцитите и туморските средини, експресијата на NNMT беше ограничена на претпоставените популации на фибробласти и туморски клетки (Слика 3, C и D). Вреди да се напомене дека не постои очигледна експресија на NNMT во ниедна популација што експресира PTPRC (CD45 +) (Слика 3D и Слика S5A), што укажува дека MNA откриена во спектарот на метаболити е внесена во Т-клетките. Експресијата на алдехид оксидаза 1 (AOX1) ја претвора MNA во 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) или 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4-PYR); Слика 3B) е исто така ограничена на популацијата на фибробласти кои експресираат COL1A1 (Слика S5A), што заедно укажува на тоа дека Т-клетките немаат способност за конвенционален метаболизам на MNA. Моделот на експресија на овие гени поврзани со MNA беше потврден со помош на втор независен сет на податоци од клетки од асцит од пациенти со HGSC (Слика S5B; n = 6) (16). Покрај тоа, анализата на квантитативната полимеразна верижна реакција (qPCR) на здрави донорски Т-клетки третирани со MNA покажа дека во споредба со контролните SK-OV-3 туморски клетки на јајниците, NNMT или AOX1 речиси и да не биле експресирани (Слика 3E). Овие неочекувани резултати укажуваат на тоа дека MNA може да се лачи од фибробласти или тумори во соседните Т-клетки во TME.
Иако кандидатите вклучуваат фамилијата на транспортери на органски катјони 1 до 3 (OCT1, OCT2 и OCT3) кодирани од фамилијата на растворливи носачи 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 и SLC22A3), потенцијалните транспортери на MNA сè уште се недефинирани (28). QPCR на mRNA од здрави донорски Т-клетки покажа ниски нивоа на експресија на SLC22A1, но неоткриени нивоа на SLC22A2, што потврди дека претходно било објавено во литературата (Слика 3F) (29). Спротивно на тоа, клеточната линија на тумор на јајници SK-OV-3 експресираше високи нивоа на двата транспортери (Слика 3F).
За да се тестира можноста Т-клетките да имаат способност да апсорбираат туѓа MNA, здрави донорски Т-клетки беа култивирани 72 часа во присуство на различни концентрации на MNA. Во отсуство на егзогена MNA, клеточната содржина на MNA не може да се открие (Слика 3G). Сепак, активираните Т-клетки третирани со егзогена MNA покажаа зголемување на содржината на MNA во клетките зависно од дозата, до 6 mM MNA (Слика 3G). Овој резултат покажува дека и покрај ниското ниво на експресија на транспортерот и недостатокот на главниот ензим одговорен за интрацелуларниот метаболизам на MNA, TIL сè уште може да апсорбира MNA.
Спектарот на метаболити во Т-клетките на пациентите и експериментите со апсорпција на MNA in vitro ја зголемуваат можноста фибробластите поврзани со рак (CAF) да лачат MNA, а туморските клетки можат да го регулираат фенотипот и функцијата на TIL. За да се утврди ефектот на MNA врз Т-клетките, здрави донорски Т-клетки беа активирани in vitro во присуство или отсуство на MNA, а нивната пролиферација и производство на цитокини беа евалуирани. По 7 дена додавање на MNA во највисока доза, бројот на удвојување на популацијата беше умерено намален, додека енергијата беше одржувана при сите дози (Слика 4А). Покрај тоа, третманот со егзогена MNA резултираше со зголемување на пропорцијата на CD4 + и CD8 + Т-клетки кои го експресираат туморскиот некроза фактор-α (TNFα; Слика 4Б). Спротивно на тоа, интрацелуларното производство на IFN-γ беше значително намалено кај CD4 + Т-клетките, но не и кај CD8 + Т-клетките, и немаше значајна промена кај интерлеукинот 2 (IL-2; Слика 4, C и D). Затоа, ензимски поврзаниот имуносорбентен тест (ELISA) на супернатант од овие Т-клеточни култури третирани со MNA покажа значително зголемување на TNFα, намалување на IFN-γ и нема промена во IL-2 (Слика 4, E до G). . Намалувањето на IFN-γ укажува дека MNA може да игра улога во инхибирањето на антитуморската активност на Т-клетките. Со цел да се симулира ефектот на MNA врз цитотоксичноста посредувана од Т-клетките, клетките на химерниот антигенски рецептор Т (FRα-CAR-T) насочени кон фолатниот рецептор α и CAR-T (GFP) регулирани од зелен флуоресцентен протеин (GFP) -CAR-T) се произведуваат од здрави донорски периферни крвни мононуклеарни клетки (PBMC). CAR-T клетките беа култивирани 24 часа во присуство на MNA, а потоа кокултивирани со човечки SK-OV-3 туморски клетки на јајниците кои го експресираат фолатниот рецептор α со ефекторен однос од 10:1. Третманот со MNA резултираше со значително намалување на активноста на убивање на FRα-CAR-T клетките, што беше слично на FRα-CAR-T клетките третирани со аденозин (Слика 4H).
(A) Вкупен број на живи клетки и удвојување на популацијата (PD) директно од културата на 7-миот ден. Графиконот со столпчиња ја претставува средната вредност + SEM на шест здрави донори. Претставува податоци од најмалку n = 3 независни експерименти. (B до D) CD3/CD28 и IL-2 беа користени за активирање на Т-клетките при нивните соодветни MNA концентрации во тек на 7 дена. Пред анализата, клетките беа стимулирани со PMA/јономицин со GolgiStop во тек на 4 часа. Експресија на TNFα (B) во Т-клетки. Пример за слика (лево) и табеларни податоци (десно) на експресијата на TNFα во живи клетки. Експресија на IFN-γ (C) и IL-2 (D) во Т-клетки. Експресијата на цитокини беше измерена со проточна цитометрија. Графиконот со столпчиња ја претставува средната вредност (n = 6 здрави донори) + SEM. Користете еднонасочна анализа на варијансата и повторени мерења (*P<0,05 и **P<0,01) за да ја одредите вредноста на P. Претставува податоци од најмалку n = 3 независни експерименти. (E до G) CD3/CD28 и IL-2 беа користени за активирање на Т-клетките при нивните соодветни MNA концентрации во тек на 7 дена. Медиумот беше собран пред и по 4 часа стимулација со PMA/јономицин. Концентрациите на TNFα (E), IFN-γ (F) и IL-2 (G) беа измерени со ELISA. Графиконот со ленти ја претставува средната вредност (n = 5 здрави донори) + SEM. P вредноста е определена со еднонасочна анализа на варијансата и повторени мерења (*P<0,05). Испрекинатата линија ја означува границата на детекција на детекцијата. (H) Тест за лиза на клетките. FRα-CAR-T или GFP-CAR-T клетките беа прилагодени со аденозин (250μM) или MNA (10 mM) во тек на 24 часа или не беа нетретирани (Ctrl). Измерен е процентот на убивање на SK-OV-3 клетките. P вредноста е определена со Welch t тест (*P<0,5 и **P<0,01).
За да се добие механистичко разбирање на регулацијата на експресијата на TNFα зависна од MNA, беа евалуирани промените во TNFα mRNA на Т-клетките третирани со MNA (Слика 5А). Здравите донорски Т-клетки третирани со MNA покажаа двојно зголемување на нивоата на транскрипција на TNFα, што укажува дека MNA зависи од транскрипциската регулација на TNFα. За да се испита овој можен регулаторен механизам, беа евалуирани два познати транскрипциски фактори кои го регулираат TNFα, имено активираниот нуклеарен фактор на Т-клетките (NFAT) и специфичниот протеин 1 (Sp1), како одговор на врзувањето на MNA за проксималниот TNFα промотор (30). TNFα промоторот содржи 6 идентификувани места за врзување на NFAT и 2 места за врзување на Sp1, кои се преклопуваат на едно место [-55 базни парови (bp) од 5'cap] (30). Хроматин имунопреципитацијата (ChIP) покажа дека кога се третира со MNA, врзувањето на Sp1 за TNFα промоторот се зголемило три пати. Вклучувањето на NFAT исто така се зголемило и се приближило до важност (Слика 5Б). Овие податоци укажуваат дека MNA ја регулира експресијата на TNFα преку Sp1 транскрипција, а во помала мера и експресијата на NFAT.
(A) Во споредба со Т-клетките култивирани без MNA, промената на TNFα експресијата кај Т-клетките третирани со MNA е прикажана како шема на експресија со SEM (n = 5 здрави донори). Претставува податоци од најмалку n = 3 независни експерименти. (B) TNFα промоторот на Т-клетките третирани со или без 8 mM MNA по NFAT и Sp1 беше комбиниран со (Ctrl) и стимулација со PMA/јономицин во тек на 4 часа. Имуноглобулин G (IgG) и H3 беа користени како негативни и позитивни контроли за имунопреципитација, соодветно. Квантификацијата на ChIP покажа дека врзувањето на Sp1 и NFAT за TNFα промоторот во клетките третирани со MNA се зголемило неколку пати во споредба со контролата. Претставува податоци од најмалку n = 3 независни експерименти. P вредноста е одредена со повеќекратни t-тестови (*** P <0,01). (C) Во споредба со асцитот на HGSC, Т-клетките (нецитотоксични) покажаа зголемена експресија на TNF во туморот. Боите претставуваат различни пациенти. Прикажаните клетки се случајно земени како примероци до 300 и се раздвижени за да се ограничи преголемото количество (** Padj = 0,0076). (D) Предложен модел на MNA за рак на јајници. MNA се произведува во туморски клетки и фибробласти во TME и е апсорбирана од Т-клетките. MNA го зголемува врзувањето на Sp1 за промотерот на TNFα, што доведува до зголемена транскрипција на TNFα и производство на цитокини на TNFα. MNA, исто така, предизвикува намалување на IFN-γ. Инхибицијата на функцијата на Т-клетките води до намалена способност за убивање и забрзан раст на туморот.
Според извештаите, TNFα има антитуморски и антитуморски ефекти зависни од напред и назад, но има добро позната улога во промовирањето на растот и метастазите на ракот на јајниците (31-33). Според извештаите, концентрацијата на TNFα во асцитот и туморските ткива кај пациенти со рак на јајниците е поголема од онаа во бенигните ткива (34-36). Во однос на механизмот, TNFα може да ја регулира активацијата, функцијата и пролиферацијата на белите крвни клетки и да го промени фенотипот на клетките на ракот (37, 38). Во согласност со овие наоди, анализата на диференцијалната генска експресија покажа дека TNF е значително зголемен во Т-клетките во туморските ткива во споредба со асцитот (Слика 5C). Зголемувањето на експресијата на TNF беше очигледно само кај популациите на Т-клетки со нецитотоксичен фенотип (Слика S5A). Накратко, овие податоци го поддржуваат ставот дека MNA има двојни имуносупресивни и туморски ефекти во HGSC.
Флуоресцентното обележување базирано на проточна цитометрија стана главен метод за проучување на метаболизмот на TIL. Овие студии покажаа дека во споредба со лимфоцитите од периферната крв или Т-клетките од секундарните лимфоидни органи, глувчешките и човечките TIL имаат поголема тенденција за апсорпција на гликоза (4, 39) и постепено губење на митохондријалната функција (19, 40). Иако забележавме слични резултати во оваа студија, клучниот развој е да се спореди метаболизмот на туморските клетки и TIL од истото ресецирано туморско ткиво. Во согласност со некои од овие претходни извештаи, туморските (CD45-EpCAM +) клетки од асцит и тумори имаат поголемо апсорпција на гликоза од CD8 + и CD4 + Т-клетките, што потврдува дека високото апсорпција на гликоза од туморските клетки може да се спореди со Т-клетките. Концептот на конкуренција на Т-клетките. TME. Сепак, митохондријалната активност на туморските клетки е поголема од онаа на CD8 + Т-клетките, но митохондријалната активност е слична на онаа на CD4 + Т-клетките. Овие резултати ја зајакнуваат новата тема дека оксидативниот метаболизам е важен за туморските клетки (41, 42). Тие исто така сугерираат дека CD8 + Т-клетките може да бидат поподложни на оксидативна дисфункција од CD4 + Т-клетките, или дека CD4 + Т-клетките може да користат извори на јаглерод освен гликоза за да ја одржат митохондријалната активност (43, 44). Треба да се напомене дека не забележавме никаква разлика во апсорпцијата на гликоза или митохондријалната активност помеѓу CD4 + Т ефекторите, Т ефекторската меморија и Т-централните мемориски клетки кај асцит. Слично на тоа, состојбата на диференцијација на CD8 + Т-клетките кај туморите нема никаква врска со промените во апсорпцијата на гликоза, што ја истакнува значајната разлика помеѓу Т-клетките култивирани in vitro и човечките TIL in vivo (22). Овие набљудувања беа потврдени и со употребата на непристрасна автоматска алокација на популацијата на клетки, што дополнително откри дека CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + клетките со поголема апсорпција на гликоза и митохондријална активност од туморските клетки се распространети, но имаат метаболички активна популација на клетки. Оваа популација може да ја претставува претпоставената подпопулација на миелоидни супресорни клетки или плазмоцитоидни дендритични клетки идентификувани во scRNA-seq анализата. Иако и двата случаи се забележани кај тумори на јајниците кај луѓето [45], тие сè уште бараат понатамошна работа за да се опише оваа миелоидна субпопулација.
Иако методите базирани на проточна цитометрија можат да ги разјаснат општите разлики во метаболизмот на гликозата и оксидативниот метаболизам помеѓу типовите на клетки, прецизните метаболити произведени од гликоза или други извори на јаглерод за митохондријален метаболизам во TME сè уште не се утврдени. Доделувањето на присуството или отсуството на метаболити на даден TIL подмножество бара прочистување на клеточната популација од исеченото ткиво. Затоа, нашиот метод за збогатување на клетките во комбинација со масена спектрометрија може да обезбеди увид во метаболитите кои се диференцијално збогатени во Т-клетките и популациите на туморски клетки во соодветни примероци од пациенти. Иако овој метод има предности во однос на сортирањето на клетките активирани со флуоресценција, одредени библиотеки на метаболити може да бидат засегнати поради вродената стабилност и/или брзата стапка на обрт (22). Сепак, нашиот метод беше во можност да идентификува два препознаени имуносупресивни метаболити, аденозин и кинуренин, бидејќи тие варираат многу помеѓу типовите на примероци.
Нашата метабономска анализа на тумори и TIL подтипови дава повеќе увид во улогата на метаболитите во TME на јајниците. Прво, користејќи проточна цитометрија, утврдивме дека нема разлика во митохондријалната активност помеѓу туморите и CD4 + Т клетките. Сепак, LC-MS/MS анализата откри значајни промени во изобилството на метаболити кај овие популации, што укажува дека заклучоците за метаболизмот на TIL и неговата целокупна метаболичка активност бараат внимателно толкување. Второ, MNA е метаболит со најголема разлика помеѓу CD45-клетките и Т клетките кај асцит, а не кај тумори. Затоа, компартментализацијата и локацијата на туморот може да имаат различни ефекти врз метаболизмот на TIL, што ја истакнува можната хетерогеност во дадена микросредина. Трето, експресијата на ензимот NNMT што произведува MNA е главно ограничена на CAF, кој е во помала мера туморски клетки, но се забележуваат нивоа на MNA кај Т-клетките добиени од тумор. Преекспресијата на NNMT во CAF на јајниците има познат ефект на промовирање на ракот, делумно поради промоцијата на метаболизмот на CAF, инвазијата на туморот и метастазите (27). Иако вкупното ниво на TIL е умерено, експресијата на NNMT во CAF е тесно поврзана со мезенхималниот подтип на Атласот на геномот на ракот (TCGA), кој е поврзан со лоша прогноза (27, 46, 47). Конечно, експресијата на ензимот AOX1 одговорен за деградација на MNA е исто така ограничена на популацијата на CAF, што укажува дека Т-клетките немаат способност да го метаболизираат MNA. Овие резултати ја поддржуваат идејата дека иако е потребна понатамошна работа за да се потврди ова откритие, високите нивоа на MNA во Т-клетките може да укажуваат на присуство на имуносупресивна микросредина на CAF.
Со оглед на ниското ниво на експресија на транспортерите на MNA и неоткриените нивоа на клучните протеини вклучени во метаболизмот на MNA, присуството на MNA во Т-клетките е неочекувано. Ниту NNMT ниту AOX1 не можеа да се детектираат со scRNA-seq анализа и целна qPCR на две независни кохорти. Овие резултати укажуваат дека MNA не се синтетизира од Т-клетките, туку се апсорбира од околните TME. Експериментите in vitro покажуваат дека Т-клетките имаат тенденција да акумулираат егзогена MNA.
Нашите ин витро студии покажаа дека егзогената MNA индуцира експресија на TNFα во Т-клетките и го подобрува врзувањето на Sp1 за промотерот на TNFα. Иако TNFα има и антитуморска и антитуморска функција, кај ракот на јајниците, TNFα може да го поттикне растот на ракот на јајниците (31-33). Неутрализацијата на TNFα во културата на туморски клетки на јајниците или елиминацијата на TNFα сигналот кај глувчешки модели може да го подобри производството на воспалителни цитокини посредувани од TNFα и да го инхибира растот на туморот (32, 35). Затоа, во овој случај, MNA добиена од TME може да дејствува како про-воспалителен метаболит преку TNFα-зависен механизам преку автокрината јамка, со што се промовира појавата и ширењето на ракот на јајниците (31). Врз основа на оваа можност, блокадата на TNFα се изучува како потенцијален терапевтски агенс за рак на јајниците (37, 48, 49). Покрај тоа, MNA ја нарушува цитотоксичноста на CAR-T клетките кон туморските клетки на јајниците, обезбедувајќи дополнителни докази за имуносупресија посредувана од MNA. Заедно, овие резултати сугерираат модел во кој туморите и CAF клетките лачат MNA во екстрацелуларен TME. Преку (i) стимулација на растот на ракот на јајниците предизвикана од TNF и (ii) инхибиција на цитотоксичната активност на Т-клетките предизвикана од MNA, ова може да има двоен туморски ефект (Слика 5D).
Како заклучок, со примена на комбинација од брзо збогатување на клетките, секвенционирање на единечни клетки и метаболичко профилирање, оваа студија откри огромни имунометаболомски разлики помеѓу туморските и асцитните клетки кај пациенти со HGSC. Оваа сеопфатна анализа покажа дека постојат разлики во апсорпцијата на гликоза и митохондријалната активност помеѓу Т-клетките и ја идентификуваше MNA како неклеточен автономен имунолошки регулаторен метаболит. Овие податоци имаат влијание врз тоа како TME влијае на метаболизмот на Т-клетките кај човечките карциноми. Иако е пријавена директна конкуренција за хранливи материи помеѓу Т-клетките и клетките на ракот, метаболитите можат да дејствуваат и како индиректни регулатори за да ја промовираат прогресијата на туморот и евентуално да ги потиснат ендогените имунолошки одговори. Понатамошниот опис на функционалната улога на овие регулаторни метаболити може да отвори алтернативни стратегии за подобрување на антитуморскиот имунолошки одговор.
Примероците од пациентите и клиничките податоци беа добиени преку складиштето за ткиво од тумор на рак во Британска Колумбија, сертифицирано од Канадската мрежа за складирање на ткива. Според протоколот одобрен од Комитетот за етика за истражување на ракот во Британска Колумбија и Универзитетот во Британска Колумбија (H07-00463), сите примероци и клинички податоци од пациентите добија информирана писмена согласност или формално се откажаа од нивната согласност. Примероците се чуваат во сертифицираната BioBank (BRC-00290). Деталните карактеристики на пациентите се прикажани во табелите S1 и S5. За криопрезервација, се користи скалпел за механичко разградување на примерокот од тумор на пациентот, а потоа се протнува низ филтер од 100 микрони за да се добие суспензија од единечни клетки. Асцитот на пациентот беше центрифугиран на 1500 вртежи во минута 10 минути на 4°C за да се пелетираат клетките и да се отстрани супернатантот. Клетките добиени од тумор и асцит беа криоконзервирани во 50% термички инактивиран човечки AB серум (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) и 10% диметил сулфоксид. Овие конзервирани суспензии од единечни клетки беа одмрзнати и употребени за метаболомика и одредување на метаболити опишани подолу.
Комплетниот медиум се состои од 0,22 μm филтриран 50:50 дополнет RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) дополнет со 10% термички инактивиран човечки AB серум (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x раствор на пеницилин стрептомицин (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) и 50 μMB-меркаптоетанол. AimV (Invitrogen) е дополнет со 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) и 2 mM l-глутамин (Thermo Fisher Scientific). Пуферот за боење на проточен цитометар се состоел од 0,22 μm филтриран фосфатно пуфериран солен раствор (PBS; Invitrogen) дополнет со 3% термички инактивиран човечки AB серум (Sigma). Буферот за збогатување на клетките е составен од 0,22 μm филтриран PBS и дополнет со 0,5% термички инактивиран човечки AB серум (Sigma-Aldrich).
Во комплетен медиум на 37°C, клетките беа обоени со 10 nM MT DR и 100 μM 2-NBDG во тек на 30 минути. Потоа, клетките беа обоени со боја за одржливост eF506 на 4°C во тек на 15 минути. Ресуспендирајте ги клетките во FC Block (eBioscience) и Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), разредете во пуфер за боење со проточен цитометар (според упатствата на производителот) и инкубирајте 10 минути на собна температура. Обојте ги клетките со сет антитела (Табела S2) во пуфер за боење со проточна цитометрија на 4°C во тек на 20 минути. Ресуспендирајте ги клетките во пуфер за боење со проточна цитометрија (конфигурација Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R) пред анализата. Користете SpectroFlo и FlowJo V10 за да ги анализирате податоците за бројот на клетки и користете GraphPad Prism 8 за да ги креирате податоците. Средниот интензитет на флуоресценција (MFI) на 2-NBDG и MT DR беше логаритамски нормализиран, а потоа беше користен спарен t-тест за статистичка анализа за да се земат предвид совпаднатите пациенти. Отстранете ги сите популации со помалку од 40 настани од анализата; внесете MFI вредност од 1 за сите негативни вредности пред да извршите статистичка анализа и визуелизација на податоците.
За да ја дополниме стратегијата за рачно затворање на горенаведениот панел за процеси, ја користевме целосната анотација од дрвото за ограничување на обликот (FAUST) (21) за автоматски да доделиме клетки на популацијата по елиминирањето на мртвите клетки во FlowJo. Рачно го управуваме излезот за да споиме популации кои се чини дека се погрешно распределени (комбинирање на PD1+ со PD1-туморски клетки) и задржани популации. Секој примерок содржи просечно повеќе од 2% клетки, за вкупно 11 популации.
За одвојување на PBMC од производите за одвојување на леукоцити беше користена центрифугирање со градиент на густина на фикол (STEMCELL Technologies). CD8 + Т-клетките беа изолирани од PBMC со помош на CD8 MicroBeads (Miltenyi) и експандирани во комплетен медиум со помош на TransAct (Miltenyi) 2 недели според упатствата на производителот. Клетките беа дозволени да отстојат 5 дена во комплетен медиум што содржи IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), а потоа повторно стимулирани со TransAct. На 7-миот ден, според упатствата на производителот, човечки CD45 MicroBeads (Miltenyi) беа користени за збогатување на клетките во три последователни рунди. Клетките беа аликвотирани за анализа на проточна цитометрија (како што е опишано погоре), а еден милион клетки беа аликвотирани три пати за LC-MS/MS анализа. Примероците беа обработени со LC-MS/MS како што е опишано подолу. Ја проценивме вредноста на недостасувачкиот метаболит со јонски број од 1.000. Секој примерок се нормализира со вкупниот јонски број (TIC), логаритамски конвертиран и автоматски нормализиран во MetaboAnalystR пред анализата.
Суспензијата од единечни клетки на секој пациент беше одмрзната и филтрирана низ филтер од 40 μm во комплетен медиум (како што е опишано погоре). Според протоколот на производителот, три последователни рунди на позитивна селекција со магнетно раздвојување со употреба на MicroBeads (Miltenyi) беа користени за збогатување на примероците за CD8+, CD4+ и CD45- клетки (на мраз). Накратко, клетките се ресуспендираат во пуфер за збогатување на клетки (како што е опишано погоре) и се бројат. Клетките беа инкубирани со човечки CD8 зрна, човечки CD4 зрна или човечки CD45 зрна (Miltenyi) на 4°C во тек на 15 минути, а потоа се мијат со пуфер за збогатување на клетки. Примерокот се пренесува низ LS колоната (Miltenyi), а позитивните и негативните фракции се собираат. За да се намали времетраењето и да се максимизира чекорот на обновување на клетките, CD8-фракцијата потоа се користи за втората рунда на збогатување на CD4+, а CD4-фракцијата се користи за последователното збогатување на CD45. Чувајте го растворот на мраз во текот на целиот процес на раздвојување.
За да се подготват примероците за анализа на метаболити, клетките беа измиени еднаш со ледено ладен раствор на сол, а на секој примерок беше додаден 1 ml 80% метанол, потоа беа измешани во вртежен момент и брзо замрзнати во течен азот. Примероците беа подложени на три циклуси на замрзнување-одмрзнување и центрифугирани на 14.000 вртежи во минута во тек на 15 минути на 4°C. Супернатантот што ги содржи метаболитите испарува додека не се исуши. Метаболитите беа повторно растворени во 50 μl 0,03% мравја киселина, измешани во вртежен момент, а потоа центрифугирани за да се отстранат остатоците.
Екстрактирајте ги метаболитите како што е опишано погоре. Префрлете го супернатантот во шише со високо-перформансна течна хроматографија за метаболомичко истражување. Користете протокол за случаен третман за да го третирате секој примерок со сличен број клетки за да спречите ефекти на серии. Извршивме квалитативна проценка на глобалните метаболити претходно објавена на AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Хроматографската анализа и интеграцијата на површината на врвовите беа извршени со користење на софтверот MultiQuant верзија 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
За да се процени вредноста на недостасувачкиот метаболит, беше користен број на јони од 1000, а TIC на секој примерок беше користен за да се пресмета нормализираната површина на пикот на секој детектиран метаболит за да се корегираат промените воведени со инструменталната анализа од обработката на примерокот. Откако TIC ќе се нормализира, MetaboAnalystR(51) (стандарден параметар) се користи за логаритамска конверзија и автоматско скалирање на нормалните линии. Користевме PCA со vegan R пакет за да извршиме истражувачка анализа на разликите во метаболомите помеѓу типовите на примероци и користевме анализа на делумна редундантност за да ги анализираме пациентите. Користевме Ward метод за да конструираме дендрограм на топлинска мапа за да го групираме Евклидовото растојание помеѓу примероците. Користевме limma (52) за стандардизирано изобилство на метаболити за да идентификуваме различно изобилни метаболити низ целиот тип на клетка и микросредина. За да го поедноставиме објаснувањето, го користиме параметарот за средна вредност на групата за да го специфицираме моделот и ги земаме предвид типовите на клетки во микросредината како секоја група (n = 6 групи); За тестот за значајност, извршивме три повторени мерења за секој метаболит. За да избегнеме лажна репликација, пациентот беше вклучен како пречка во дизајнот на лимата. За да ги провериме разликите во метаболитите помеѓу различните пациенти, го прилагодивме моделот на лима вклучувајќи ги пациентите на фиксен начин. Ја известуваме значајноста на претходно наведениот контраст помеѓу типот на клетка и микросредината на Padj <0,05 (корекција на Benjamini-Hochberg).
По збогатување со енергија со помош на комплетот за отстранување на мртви клетки Miltenyi (>80% одржливост), секвенционирање на транскриптом на единечни клетки беше извршено на вкупниот број живи замрзнати примероци од асцит и тумор користејќи протокол за експресија на ген 10x 5′. Анализирани беа пет случаи со соодветни тумори и асцит, иако ниската одржливост од еден примерок од тумор го спречи неговото вклучување. За да постигнеме повеќекратна селекција на пациенти, ги комбиниравме примероците од секој пациент во лентите на контролерот 10x хром и ги анализиравме асцитите и местата на туморот одделно. По секвенционирањето [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp парен крај (PE), геном на Квебек; Со просек од 73.488 и 41.378 читања по клетка за тумор и асцит, соодветно]], ги користевме CellSNP и Vireo (53) (врз основа на CellSNP како). На вообичаениот човечки SNP (VCF) обезбеден од GRCh38 му е доделен идентитет на донор. Користиме SNPRelate за да го заклучиме најблискиот идентитет (IBS) на статусот на генотипот на пациентот (IBS), исклучувајќи ги недоделените клетки и клетките идентификувани како дуплекси и соодветните донори помеѓу примероците од асцит и тумор (54). Врз основа на оваа задача, задржавме три случаи со изобилство на клеточна репрезентација во туморот и асцитот за анализа низводно. По извршувањето на чекор на масовна филтрација во пакувањето на BioConductor со расејувач (55) и скенирање (56), ова даде 6975 клетки (2792 и 4183 клетки од тумор и асцит, соодветно) за анализа. Користиме групирање на igraph (57) од Лувен на споделена мрежа на најблиски соседи (SNN) врз основа на Жакардовото растојание до клетките на кластерот преку експресија. Кластерите беа рачно анотирани на претпоставени типови на клетки врз основа на експресијата на маркерските гени и визуелизирани со t-SNE. Цитотоксичните Т-клетки се дефинирани со експресијата на CD8A и GZMA, исклучувајќи ги субкластерите со ниска експресија на рибозомални протеини. Пристапивме до објавените податоци на Izar et al. (16), вклучувајќи го и нивното вградување на t-SNE, кое може да го контролира преклопувањето на експресијата помеѓу маркерите на имуните клетки и експресијата на NNMT.
PBMC беа одвоени од производите за одвојување на леукоцити (STEMCELL Technologies) со центрифугирање со градиент на густина на Ficoll. CD3 + клетките беа изолирани од PBMC со користење на CD3 зрна (Miltenyi). Во присуство или отсуство на MNA, CD3+ клетките беа активирани со CD3 врзан за плоча (5μg/ml), растворлив CD28 (3μg/ml) и IL-2 (300 U/ml; Proleukin). На последниот ден од експанзијата, одржливоста (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) и пролиферацијата (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) беа оценети со проточна цитометрија. Оценете ја ефекторската функција со стимулирање на клетките со PMA (20 ng/ml) и јономицин (1μg/ml) со GolgiStop во тек на 4 часа и следете ги CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) и TNFα-флуоресцеин изотиоцијанат (FITC) (MAb11, BD). Стимулирајте ги qPCR и ChIP клетките со PMA (20 ng/ml) и јономицин (1μg/ml) во тек на 4 часа. ELISA супернатантот беше собран пред и по стимулацијата со PMA (20 ng/ml) и јономицин (1 μg/ml) во тек на 4 часа.
Следете го протоколот на производителот за да изолирате РНК користејќи го RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Користете QIAshredder (QIAGEN) за да го хомогенизирате примерокот. Користете комплет за РНК со висок капацитет за cDNA (Thermo Fisher Scientific) за синтеза на комплементарна ДНК (cDNA). Користете TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) за да квантифицирате генска експресија (според протоколот на производителот) со следниве сонди: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [глицералдехид-3-фосфат надвор од водород (GAPDH)] и Hs01010726_m1 (SLC22A2). Примероците беа анализирани на системот StepOnePlus PCR во реално време (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) во брзата оптичка реакциона плоча MicroAmp со 96 бунари (Applied Biosystems) со MicroAmp оптички филм. Секоја Ct вредност што надминува 35 се смета за над прагот на детекција и е означена како неоткривачка.
Извршете ChIP како што е претходно опишано (58). Накратко, клетките беа третирани со формалдехид (конечна концентрација 1,42%) и инкубирани на собна температура 10 минути. Користете дополнет пуфер за отекување (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl и 0,1% NP-40) на мраз 10 минути, а потоа ресуспендирајте во пуфер за имунопреципитација како што е опишано (58). Потоа примерокот беше соникиран со следните циклуси: 10 циклуси (20 импулси од 1 секунда) и статичко време од 40 секунди. Инкубирајте антитела од ChIP-квалитетен имуноглобулин G (технологија за клеточна сигнализација; 1μl), хистон H3 (технологија за клеточна сигнализација; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) и SP1 (технологија за клеточна сигнализација; 3μl) со примерокот на 4°CC, протресете преку ноќ. Инкубирајте ги протеинските зрна А (Thermo Fisher Scientific) со примерокот на 4°C со нежно тресење 1 час, потоа користете хелекс зрна (Bio-Rad) за збогатување на ДНК и користете протеиназа К (Thermo Fisher) за варење на протеините. Промоторот на TNFα беше детектиран со PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; напротив, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (производ од 207 bp). Сликите беа произведени од Image Lab (Bio-Rad) и квантифицирани со помош на софтверот ImageJ.
Супернатантот од клеточната култура беше собран како што е опишано погоре. Определувањето беше извршено според процедурите на производителот за комплетот за ELISA за човечки TNFα (Invitrogen), комплетот за ELISA за човечки IL-2 (Invitrogen) и комплетот за ELISA за човечки IFN-γ (Abcam). Според протоколот на производителот, супернатантот беше разреден 1:100 за откривање на TNFα и IL-2 и 1:3 за откривање на IFN-γ. Користете EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) за мерење на апсорпцијата на 450 nm.
PBMC беа одвоени од производите за одвојување на леукоцити (STEMCELL Technologies) со центрифугирање со градиент на густина на Ficoll. CD3 + клетките беа изолирани од PBMC со користење на CD3 зрна (Miltenyi). Во присуство или отсуство на MNA, CD3+ клетките беа активирани со CD3 врзан за плоча (5μg/ml), растворлив CD28 (3μg/ml) и IL-2 (300 U/ml; Proleukin) во тек на 3 дена. По 3 дена, клетките беа собрани и измиени со 0,9% физиолошки раствор, а пелетот беше брзо замрзнат. Броењето на клетките беше извршено со проточна цитометрија (Cytek Aurora; конфигурација 3L-16V-14B-8R) со користење на 123count eBeads.
Екстрактирајте ги метаболитите како што е опишано погоре. Сувиот екстракт е реконституиран во концентрација од 4000 клеточни еквиваленти/μl. Анализирајте го примерокот со обратна фазна хроматографија (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) и CORTECS T3 колона (2,1×150 mm, големина на честички 1,6-μm, големина на пори 120-Å; #186008500, Waters). Поларен масен спектрометар (6470, Agilent), во кој електроспреј јонизацијата работи во позитивен режим. Мобилната фаза А е 0,1% мравја киселина (во H2O), мобилната фаза Б е 90% ацетонитрил, 0,1% мравја киселина. LC градиентот е од 0 до 2 минути за 100% A, од 2 до 7,1 минути за 99% B и од 7,1 до 8 минути за 99% B. Потоа, повторно изедначете ја колоната со мобилната фаза A со брзина на проток од 0,6 ml/min во тек на 3 минути. Брзината на проток е 0,4 ml/min, а комората на колоната се загрева на 50°C. Користете го чистохемискиот стандард на MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) за да го одредите времето на задржување (RT) и трансформацијата (RT = 0,882 минути, трансформација 1 = 137→94,1, трансформација 2 = 137→92, Конверзија 3 = 137→78). Кога сите три транзиции се случуваат во точното време на задржување, транзицијата 1 се користи за квантификација за да се обезбеди специфичност. Стандардната крива на MNA (Toronto Research Chemical Company) беше генерирана со шест сериски разредувања на основниот раствор (1 mg/ml) за да се добијат стандарди од 0,1, 1,0, 10 и 100 ng/ml и 1,0 и 10μg/ml соодветно течност. Границата на детекција е 1 ng/ml, а линеарниот одговор е помеѓу 10 ng/ml и 10μg/ml. Секоја инјекција од два микролитри примерок и стандард се користи за LC/MS анализа, а мешан примерок за контрола на квалитетот се дава на секои осум инјекции за да се обезбеди стабилноста на платформата за анализа. MNA одговорите на сите клеточни примероци третирани со MNA беа во рамките на линеарниот опсег на анализата. Анализата на податоците беше извршена со користење на софтверот за квантитативна анализа MassHunter (v9.0, Agilent).
Конструктот од αFR-CAR од втората генерација е земен од Song et al. (59). Накратко, конструктот ги содржи следните содржини: CD8a водечка секвенца, човечки αFR-специфичен варијабилен фрагмент од еден синџир, CD8a шарка и трансмембрански регион, CD27 интрацелуларен домен и CD3z интрацелуларен домен. Целосната CAR секвенца е синтетизирана од GenScript, а потоа клонирана во вектор за експресија на лентивирус од втора генерација пред касетата за експресија на GFP што се користи за евалуација на ефикасноста на трансдукцијата.
Лентивирусот се произведува со трансфекција на клетки HEK293T [Американска колекција на типски култури (ATCC); одгледуван во модифициран медиум Dulbecco's Eagle што содржи 10% фетален говедски серум (FBS) и 1% PenStrep, и користен е CAR-GFP вектор, а плазмидите за пакување (psPAX2 и pMD2.G, Addgene) користат липофекциски амин (Sigma-Aldrich). Супернатантот што го содржи вирусот е собран 48 и 72 часа по трансфекцијата, филтриран и концентриран со ултрацентрифугирање. Чувајте го концентрираниот вирусен супернатант на -80°C до трансдукција.
PBMC се одделуваат од производите за сепарација на леукоцити од здрави донори (STEMCELL Technologies) со центрифугирање на густина на градиент Ficoll. Користете CD8 микрозрнца со позитивна селекција (Miltenyi) за да изолирате CD8+ клетки од PBMC. Стимулирајте ги Т-клетките со TransAct (Miltenyi) и во TexMACS медиум [Miltenyi; дополнет со 3% термички инактивиран човечки серум, 1% PenStrep и IL-2 (300 U/ml)]. Дваесет и четири часа по стимулацијата, Т-клетките беа трансдуцирани со лентивирус (10 μl концентриран вирусен супернатант на 106 клетки). 1 до 3 дена по трансдукцијата на Cytek Aurora (на FSC (напредно расејување)/SSC (странично расејување), Синглет, GFP+), оценете ја GFP експресијата на клетките за да демонстрирате ефикасност на трансдукција од најмалку 30%.
CAR-T клетките беа култивирани 24 часа во Immunocult (STEMCELL Technologies; дополнето со 1% PenStrep) под следниве услови: нетретирани, третирани со 250 μM аденозин или 10 mM MNA. По претходниот третман, CAR-T клетките беа измиени со PBS и комбинирани со 20.000 SK-OV-3 клетки [ATCC; во McCoy 5A медиум (Sigma-Aldrich) дополнет со 10% FBS и 1% PenStrep на 10: Односот ефектор-цел од 1 беше амплифициран во три примероци во дополнет Immunocult медиум. SK-OV-3 клетките и SK-OV-3 клетките лизирани со дигиталис сапонин (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) беа користени како негативни и позитивни контроли, соодветно. По 24 часа кокултивација, супернатантот беше собран и лактат дехидрогеназата (LDH) беше измерена според упатствата на производителот (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Супернатантот на LDH беше разреден 1:50 во LDH пуфер. Процентот на убивање беше измерен со помош на следната формула: процент на убивање = процент на корекција / максимална стапка на убивање x 100%, каде што процент на корекција = само кокултура - Т-клетки, а максимална стапка на убивање = позитивна контрола - негативна контрола.
Како што е опишано во текстот или материјалите и методите, користете GraphPad Prism 8, Microsoft Excel или R v3.6.0 за статистичка анализа. Доколку се соберат повеќе примероци од истиот пациент (како што се асцит и тумор), користиме спарен t-тест или го вклучуваме пациентот како случаен ефект во линеарен или генерализиран модел, по потреба. За метаболомичка анализа, тестот за важност се изведува во три примероци.
За дополнителни материјали за овој напис, видете http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ова е статија со отворен пристап дистрибуирана според условите на лиценцата „Криејтив комонс“ - Наведи извор - Некомерцијално, која дозволува употреба, дистрибуција и репродукција во кој било медиум, сè додека конечната употреба не е за комерцијална добивка и премисата е дека оригиналното дело е точно. Референца.
Забелешка: Ве молиме само да ја наведете вашата е-адреса за лицето што го препорачувате на страницата да знае дека сакате да ја види е-поштата и дека не е спам. Нема да ги снимиме е-адресите.
Ова прашање се користи за да се провери дали сте посетител и да се спречи автоматско поднесување на спам.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Мекферсон (Сара Мекферсон), Лорен Џ. Захаријас (Лорен Г. Захаријас), Абигејл Ели Арис Г. ДеБерардинис), Расел Г. Џонс (Расел Г. Џонс), Финес Т. Хамилтон (Финес Т.
MNA придонесува за имуносупресија на Т-клетките и претставува потенцијална имунотерапевтска цел за третман на рак кај луѓето.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Мекферсон (Сара Мекферсон), Лорен Џ. Захаријас (Лорен Г. Захаријас), Абигејл Ели Арис Г. ДеБерардинис), Расел Г. Џонс (Расел Г. Џонс), Финес Т. Хамилтон (Финес Т.
MNA придонесува за имуносупресија на Т-клетките и претставува потенцијална имунотерапевтска цел за третман на рак кај луѓето.
©2021 Американско здружение за унапредување на науката. сите права се задржани. AAAS е партнер на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.