Пропионската киселина (PPA), антифунгален агенс и вообичаен додаток во исхраната, покажа дека предизвикува абнормален невроразвој кај глувци придружен со гастроинтестинална дисфункција, што може да биде предизвикано од цревна дисбиоза. Посочена е врска помеѓу изложеноста на PPA во исхраната и дисбиозата на цревната микробиота, но не е директно истражена. Овде, ги истраживме промените поврзани со PPA во составот на цревната микробиота што можат да доведат до дисбиоза. Цревните микробиоми на глувци хранети со нетретирана исхрана (n = 9) и исхрана збогатена со PPA (n = 13) беа секвенционирани со користење на долгорочно метагеномско секвенционирање за да се проценат разликите во микробниот состав и бактериските метаболички патишта. PPA во исхраната беше поврзана со зголемување на изобилството на значајни таксони, вклучувајќи неколку видови Bacteroides, Prevotella и Ruminococcus, чии членови претходно беа вмешани во производството на PPA. Микробиомите на глувци изложени на PPA, исто така, имаа повеќе патишта поврзани со липидниот метаболизам и биосинтезата на стероидни хормони. Нашите резултати покажуваат дека PPA може да ја промени цревната микробиота и нејзините поврзани метаболички патишта. Овие забележани промени истакнуваат дека конзервансите класифицирани како безбедни за консумирање можат да влијаат врз составот на цревната микробиота и, пак, врз здравјето на луѓето. Меѓу нив, се избираат P, G или S во зависност од нивото на класификација што се анализира. За да се минимизира влијанието на лажно позитивните класификации, беше усвоен минимален праг на релативна изобилство од 1e-4 (1/10.000 читања). Пред статистичката анализа, релативните изобилства пријавени од Bracken (fraction_total_reads) беа трансформирани со помош на трансформацијата со центриран логаритамски однос (CLR) (Aitchison, 1982). Методот CLR беше избран за трансформација на податоци бидејќи е инвариантен во скалата и доволен за неретки податочни множества (Gloor et al., 2017). CLR трансформацијата го користи природниот логаритам. Податоците за броење пријавени од Bracken беа нормализирани со помош на релативната логаритамска експресија (RLE) (Anders and Huber, 2010). Сликите беа генерирани со помош на комбинација од matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 и секвенцијални логаритми (Gloor et al., 2017). 0,12,2 и стантанотации v. 0,5,0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Односот Bacillus/Bacteroidetes беше пресметан за секој примерок користејќи нормализиран број на бактерии. Вредностите прикажани во табелите се заокружени на 4 децимални места. Индексот на разновидност на Симпсон беше пресметан користејќи ја скриптата alpha_diversity.py дадена во пакетот KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Извештајот на Бракен е даден во скриптата, а индексот на Симпсон „Si“ е даден за параметарот -an. Значајните разлики во изобилството беа дефинирани како средни разлики во CLR ≥ 1 или ≤ -1. Средната разлика во CLR од ±1 означува 2,7-кратно зголемување на изобилството на типот на примерок. Знакот (+/-) покажува дали таксонот е позастапен во примерокот PPA и контролниот примерок, соодветно. Значајноста беше утврдена со користење на Mann-Whitney U тестот (Virtanen et al., 2020). Користен е Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), а за корекција на повеќекратното тестирање беше применета постапката Benjamini-Hochberg. Како праг за утврдување на статистичката значајност беше користена прилагодена p-вредност ≤ 0.05.
Човечкиот микробиом често се нарекува „последен орган на телото“ и игра витална улога во здравјето на луѓето (Baquero and Nombela, 2012). Особено, цревниот микробиом е препознаен по неговото влијание на целиот систем и улога во многу основни функции. Комензалните бактерии се изобилни во цревата, зафаќајќи повеќе еколошки ниши, користејќи хранливи материи и натпреварувајќи се со потенцијални патогени (Jandhyala et al., 2015). Различни бактериски компоненти на цревната микробиота се способни да произведуваат есенцијални хранливи материи како што се витамини и да го поттикнуваат варењето на храната (Rowland et al., 2018). Исто така, е докажано дека бактериските метаболити влијаат на развојот на ткивата и ги подобруваат метаболичките и имунолошките патишта (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Составот на човечкиот цревен микробиом е исклучително разновиден и зависи од генетски и еколошки фактори како што се исхраната, полот, лековите и здравствената состојба (Kumbhare et al., 2019).
Мајчината исхрана е критична компонента на феталниот и неонаталниот развој и претпоставен извор на соединенија кои можат да влијаат на развојот (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Едно такво соединение од интерес е пропионската киселина (PPA), нуспроизвод на масна киселина со краток синџир добиен од бактериска ферментација и додаток во исхраната (den Besten et al., 2013). PPA има антибактериски и антифунгални својства и затоа се користи како конзерванс за храна и во индустриски апликации за инхибирање на растот на мувла и бактерии (Wemmenhove et al., 2016). PPA има различни ефекти во различни ткива. Во црниот дроб, PPA има антиинфламаторни ефекти со тоа што влијае на експресијата на цитокини во макрофагите (Kawasoe et al., 2022). Овој регулаторен ефект е забележан и кај други имунолошки клетки, што доведува до намалување на воспалението (Haase et al., 2021). Сепак, спротивен ефект е забележан во мозокот. Претходни студии покажаа дека изложеноста на PPA предизвикува однесување слично на аутизам кај глувци (El-Ansary et al., 2012). Други студии покажаа дека PPA може да предизвика глиоза и да активира проинфламаторни патишта во мозокот (Abdelli et al., 2019). Бидејќи PPA е слаба киселина, може да дифундира низ цревниот епител во крвотокот и на тој начин да ги премине рестриктивните бариери, вклучувајќи ја крвно-мозочната бариера, како и плацентата (Stinson et al., 2019), истакнувајќи ја важноста на PPA како регулаторен метаболит произведен од бактерии. Иако потенцијалната улога на PPA како фактор на ризик за аутизам во моментов е под истрага, неговите ефекти врз лицата со аутизам може да се протегаат подалеку од предизвикување на невронска диференцијација.
Гастроинтестиналните симптоми како што се дијареја и запек се чести кај пациенти со невроразвојни нарушувања (Cao et al., 2021). Претходни студии покажаа дека микробиомот на пациенти со нарушувања од аутистичниот спектар (ASD) се разликува од оној на здрави лица, што укажува на присуство на дисбиоза на цревната микробиота (Finegold et al., 2010). Слично на тоа, карактеристиките на микробиомот кај пациенти со воспалителни заболувања на цревата, дебелина, Алцхајмерова болест итн., исто така, се разликуваат од оние на здрави лица (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Сепак, до денес, не е утврдена причинско-последична врска помеѓу цревниот микробиом и невролошките заболувања или симптоми (Yap et al., 2021), иако се смета дека неколку бактериски видови играат улога во некои од овие болни состојби. На пример, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio и други родови се позастапени во микробиотата на пациенти со аутизам (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Имено, познати се членови на некои од овие родови кои поседуваат гени поврзани со производството на PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Со оглед на антимикробните својства на PPA, зголемувањето на неговото изобилство може да биде корисно за растот на бактериите што произведуваат PPA (Jacobson et al., 2018). Така, средина богата со PFA може да доведе до промени во цревната микробиота, вклучувајќи ги и гастроинтестиналните патогени, што може да бидат потенцијални фактори што доведуваат до гастроинтестинални симптоми.
Централно прашање во истражувањето на микробиомот е дали разликите во микробниот состав се причина или симптом на основните болести. Првиот чекор кон разјаснување на сложената врска помеѓу исхраната, цревниот микробиом и невролошките заболувања е да се проценат ефектите од исхраната врз микробниот состав. За таа цел, користевме долгорочно читање на метагеномско секвенционирање за да ги споредиме цревните микробиоми на потомците на глувци хранети со исхрана богата со PPA или осиромашена со PPA. Потомците биле хранети со истата исхрана како и нивните мајки. Претпоставивме дека исхраната богата со PPA ќе резултира со промени во цревниот микробен состав и микробните функционални патишта, особено оние поврзани со метаболизмот на PPA и/или производството на PPA.
Во оваа студија беа користени трансгени глувци FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) кои прекумерно го експресираат зелениот флуоресцентен протеин (GFP) под контрола на глија-специфичниот GFAP промотор, следејќи ги упатствата на Комитетот за институционална грижа и употреба на животни при Универзитетот во Централна Флорида (UCF-IACUC) (број на дозвола за употреба на животни: PROTO202000002). По одвикнувањето, глувците беа сместени индивидуално во кафези со 1-5 глувци од секој пол по кафез. Глувците беа хранети ad libitum или со прочистена контролна диета (модифицирана отворена стандардна диета, 16 kcal% масти) или со диета дополнета со натриум пропионат (модифицирана отворена стандардна диета, 16 kcal% масти, што содржи 5.000 ppm натриум пропионат). Количината на употребен натриум пропионат беше еквивалентна на 5.000 mg PFA/kg вкупна тежина на храната. Ова е највисоката концентрација на PPA одобрена за употреба како конзерванс за храна. За подготовка за оваа студија, родителските глувци беа хранети со обете диети 4 недели пред парењето и продолжија во текот на целата бременост на мајката. Потомците на глувците [22 глувци, 9 контролни (6 мажјаци, 3 женки) и 13 PPA (4 мажјаци, 9 женки)] беа одбиени од доенчиња, а потоа продолжија со истата исхрана како и мајките 5 месеци. Потомците на глувците беа жртвувани на 5-месечна возраст, а нивната содржина од цревниот фекал беше собрана и првично складирана во микроцентрифугални епрувети од 1,5 ml на -20°C, а потоа префрлена во замрзнувач на -80°C додека не се исцрпи ДНК-та на домаќинот и не се екстрахираат микробните нуклеински киселини.
ДНК-та на домаќинот беше отстранета според модифициран протокол (Charalampous et al., 2019). Накратко, фекалната содржина беше префрлена во 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) и складирана замрзната. Обработете максимум 1-2 фекални пелети по екстракција. Фекалната содржина потоа беше механички хомогенизирана со пластичен толчник во внатрешноста на цевката за да се формира кашеста маса. Центрифугирајте ги примероците на 10.000 RCF 5 минути или додека примероците не се пелетираат, потоа аспирирајте го супернатантот и ресуспендирајте го пелетот во 250 µl 1× PBS. Додадете 250 µl 4,4% раствор на сапонин (TCI, број на производ S0019) во примерокот како детергент за олабавување на мембраните на еукариотските клетки. Примероците беа нежно измешани додека не се изедначат и инкубирани на собна температура 10 минути. Потоа, за да се разградат еукариотските клетки, во примерокот беше додадена 350 μl вода без нуклеаза, инкубирана 30 секунди, а потоа беа додадени 12 μl 5 M NaCl. Потоа, примероците беа центрифугирани на 6000 RCF 5 минути. Аспирирајте го супернатантот и ресуспендирајте го пелетот во 100 μl 1X PBS. За да се отстрани ДНК-та на домаќинот, додадете 100 μl HL-SAN пуфер (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml вода без нуклеаза) и 10 μl HL-SAN ензим (ArticZymes P/N 70910-202). Примероците беа темелно измешани со пипетирање и инкубирани на 37 °C 30 минути на 800 вртежи во минута на Eppendorf™ ThermoMixer C. По инкубацијата, центрифугирани на 6000 RCF 3 минути и измиени двапати со 800 µl и 1000 µl 1X PBS. Конечно, ресуспендирајте го пелетот во 100 µl 1X PBS.
Вкупната бактериска ДНК беше изолирана со помош на комплетот за прочистување на геномска ДНК од New England Biolabs Monarch (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Стандардната оперативна постапка што е обезбедена со комплетот е малку изменета. Инкубирајте и одржувајте вода без нуклеази на 60°C пред операцијата за конечно елуирање. Додадете 10 µl протеиназа K и 3 µl RNase A на секој примерок. Потоа додадете 100 µl пуфер за лиза на клетки и нежно измешајте. Потоа, примероците беа инкубирани во Eppendorf™ ThermoMixer C на 56°C и 1400 вртежи во минута најмалку 1 час и до 3 часа. Инкубираните примероци беа центрифугирани на 12.000 RCF во текот на 3 минути, а супернатантот од секој примерок беше префрлен во посебна микроцентрифугална епрувета од 1,5 mL што содржи 400 µL раствор за врзување. Епруветите потоа беа пулсирани во вртежен момент од 5-10 секунди во интервали од 1 секунда. Префрлете ја целата течна содржина од секој примерок (приближно 600–700 µL) во филтер-кертриџ поставен во цевка за собирање низ која се протекува. Цевките беа центрифугирани на 1.000 RCF во тек на 3 минути за да се овозможи почетно врзување на ДНК, а потоа центрифугирани на 12.000 RCF во тек на 1 минута за да се отстрани преостанатата течност. Колоната со примероци беше префрлена во нова цевка за собирање, а потоа измиена двапати. За првото миење, додадете 500 µL пуфер за миење во секоја цевка. Превртете ја цевката 3–5 пати, а потоа центрифугирајте на 12.000 RCF во тек на 1 минута. Исфрлете ја течноста од цевката за собирање и вратете ја филтер-кертриџот во истата цевка за собирање. За второто миење, додадете 500 µL пуфер за миење во филтерот без да го превртувате. Примероците беа центрифугирани на 12.000 RCF во тек на 1 минута. Префрлете го филтерот во епрувета LoBind® од 1,5 mL и додадете 100 µL претходно загреана вода без нуклеази. Филтрите беа инкубирани на собна температура 1 минута, а потоа центрифугирани на 12.000 RCF 1 минута. Елуираната ДНК беше складирана на -80°C.
Концентрацијата на ДНК беше квантифицирана со помош на Qubit™ 4.0 флуорометр. ДНК беше подготвена со помош на Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (кат. бр. Q33231) според упатствата на производителот. Распределбата на должината на ДНК фрагментите беше измерена со помош на Aglient™ 4150 или 4200 TapeStation. ДНК беше подготвена со помош на Agilent™ Genomic DNA Reagents (кат. бр. 5067-5366) и Genomic DNA ScreenTape (кат. бр. 5067-5365). Подготовката на библиотеката беше извршена со помош на Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) според упатствата на производителот. ДНК беше секвенционирана со помош на ONT GridION™ Mk1 секвенцер со Min106D проточна ќелија (R 9.4.1). Поставките за секвенционирање беа: повикување на база со висока точност, минимална q вредност од 9, поставување на баркод и намалување на баркодот. Примероците беа секвенционирани во текот на 72 часа, по што податоците од базниот повик беа доставени за понатамошна обработка и анализа.
Биоинформатичката обработка беше извршена со користење на претходно опишани методи (Greenman et al., 2024). FASTQ датотеките добиени од секвенционирањето беа поделени во директориуми за секој примерок. Пред биоинформатичката анализа, податоците беа обработени со користење на следниов процес: прво, FASTQ датотеките од примероците беа споени во една FASTQ датотека. Потоа, отчитувањата пократки од 1000 bp беа филтрирани со користење на Filtlong верзија 0.2.1, при што единствениот променет параметар беше –min_length 1000 (Wick, 2024). Пред понатамошното филтрирање, квалитетот на отчитувањето беше контролиран со користење на NanoPlot верзија 1.41.3 со следниве параметри: –fastq –plots точка –N50 -o
За таксономска класификација, читањата и склопените контизи беа класифицирани со користење на Kraken2 верзија 2.1.2 (Wood et al., 2019). Генерирајте извештаи и излезни датотеки за читања и склопувања, соодветно. Користете ја опцијата –use-names за да анализирате читања и склопувања. Опциите –gzip-компресирани и –paired се специфицирани за сегменти за читање. Релативната изобилство на таксони во метагеномите беше проценета со користење на Bracken верзија 2.8 (Lu et al., 2017). Прво креиравме база на податоци kmer што содржи 1000 бази користејќи bracken-build со следниве параметри: -d
Генската анотација и проценката на релативната изобилство беа извршени со користење на модифицирана верзија на протоколот опишан од Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Прво, контизите пократки од 500 bp беа отстранети од сите склопови со користење на SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Избраните склопови потоа беа комбинирани во пан-метагеном. Отворените рамки за читање (ORF) беа идентификувани со користење на Prodigal v. 1.0.1 (паралелна верзија на Prodigal v. 2.6.3) со следниве параметри: -d
Гените прво беа групирани според идентификаторите на ортолошките (KO) идентификатори на Кјото енциклопедија на гени и геноми (KEGG) доделени од eggNOG за да се споредат изобилствата на генските патеки. Гените без нокаути или гените со повеќекратни нокаути беа отстранети пред анализата. Потоа беше пресметана просечната изобилство на секој KO по примерок и беше извршена статистичка анализа. Гените за метаболизам на PPA беа дефинирани како секој ген на кој му беше доделен ред ko00640 во колоната KEGG_Pathway, што укажува на улога во метаболизмот на пропионат според KEGG. Гените идентификувани како поврзани со производството на PPA се наведени во Дополнителната табела 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Беа извршени тестови за пермутација за да се идентификуваат гени за метаболизам и производство на PPA кои беа значително позастапени во секој тип на примерок. За секој анализиран ген беа извршени илјада пермутации. p-вредност од 0,05 беше користена како гранична вредност за да се утврди статистичката значајност. Функционалните анотации беа доделени на поединечни гени во рамките на кластерот врз основа на анотациите на репрезентативните гени во рамките на кластерот. Таксоните поврзани со метаболизмот на PPA и/или производството на PPA можеа да се идентификуваат со споредување на контиг ID-ата во излезните датотеки на Kraken2 со истите контиг ID-а задржани за време на функционалната анотација со употреба на eggNOG. Тестирањето на значајноста беше извршено со користење на претходно опишаниот Mann-Whitney U тест. Корекцијата за повеќекратно тестирање беше извршена со користење на постапката Benjamini-Hochberg. p-вредност од ≤ 0,05 беше користена како гранична вредност за да се утврди статистичка значајност.
Разновидноста на цревниот микробиом кај глувците беше оценета со користење на индексот на разновидност на Симпсон. Не беа забележани значајни разлики помеѓу контролните и PPA примероците во однос на разновидноста на родот и видот (p-вредност за родот: 0,18, p-вредност за видот: 0,16) (Слика 1). Микробниот состав потоа беше спореден со користење на анализа на главни компоненти (PCA). Слика 2 го прикажува групирањето на примероците по нивните фила, што укажува дека има разлики во видовиот состав на микробиомите помеѓу PPA и контролните примероци. Ова групирање беше помалку изразено на ниво на род, што укажува дека PPA влијае на одредени бактерии (Дополнителна слика 1).
Слика 1. Алфа разновидност на родови и видов состав на микробиомот на цревата кај глувци. Кутиени дијаграми што ги прикажуваат индексите на разновидност на Симпсон на родовите (А) и видовите (Б) во PPA и контролни примероци. Сигнативноста беше утврдена со користење на Mann-Whitney U тестот, а повеќекратна корекција беше извршена со користење на Benjamini-Hochberg постапката. ns, p-вредноста не беше значајна (p> 0,05).
Слика 2. Резултати од анализата на главните компоненти на составот на цревниот микробиом кај глувци на ниво на вид. Графиконот за анализа на главните компоненти ја прикажува распределбата на примероците низ нивните први две главни компоненти. Боите го означуваат типот на примерокот: глувците изложени на PPA се виолетови, а контролните глувци се жолти. Главните компоненти 1 и 2 се прикажани на x-оската и y-оската, соодветно, и се изразени како нивен објаснет сооднос на варијанса.
Користејќи податоци од RLE трансформиран број, забележано е значително намалување на средниот сооднос Bacteroidetes/Bacillus кај контролните и PPA глувците (контрола: 9,66, PPA: 3,02; p-вредност = 0,0011). Оваа разлика се должеше на поголемата застапеност на Bacteroidetes кај PPA глувците во споредба со контролните, иако разликата не беше значајна (средна вредност на CLR за контрола: 5,51, средна вредност на CLR за PPA: 6,62; p-вредност = 0,054), додека застапеноста на Bacteroidetes беше слична (средна вредност на CLR за контрола: 7,76, средна вредност на CLR за PPA: 7,60; p-вредност = 0,18).
Анализата на изобилството на таксономските членови на цревниот микробиом покажа дека 1 филум и 77 видови значително се разликуваат помеѓу PPA и контролните примероци (Дополнителна табела 2). Изобилството на 59 видови во PPA примероците беше значително поголемо од она во контролните примероци, додека изобилството на само 16 видови во контролните примероци беше поголемо од она во PPA примероците (Слика 3).
Слика 3. Диференцијална изобилство на таксони во цревниот микробиом кај глувци од групата PPA и контролни глувци. Вулканските графикони прикажуваат разлики во изобилството на родовите (A) или видовите (B) помеѓу PPA и контролните примероци. Сивите точки не укажуваат на значајна разлика во изобилството на таксони. Обоените точки укажуваат на значајни разлики во изобилството (p-вредност ≤ 0,05). Првите 20 таксони со најголеми разлики во изобилството помеѓу типовите на примероци се прикажани со црвена и светло сина боја (контролни и PPA примероци), соодветно. Жолтите и виолетовите точки беа најмалку 2,7 пати позастапени во контролните или PPA примероците отколку во контролните. Црните точки претставуваат таксони со значително различни изобилства, со средни разлики во CLR помеѓу -1 и 1. P вредностите беа пресметани со користење на Mann-Whitney U тестот и коригирани за повеќекратно тестирање со користење на постапката Benjamini-Hochberg. Задебелените средни разлики во CLR укажуваат на значајни разлики во изобилството.
Откако го анализиравме составот на цревната микробна структура, извршивме функционална анотација на микробиомот. Откако ги филтриравме гените со низок квалитет, беа идентификувани вкупно 378.355 уникатни гени во сите примероци. Трансформираната изобилство на овие гени беше искористена за анализа на главните компоненти (PCA), а резултатите покажаа висок степен на групирање на типовите примероци врз основа на нивните функционални профили (Слика 4).
Слика 4. Резултати од PCA користејќи го функционалниот профил на микробиомот на цревата кај глувци. PCA графиконот ја прикажува распределбата на примероците низ нивните први две главни компоненти. Боите го означуваат типот на примерокот: глувците изложени на PPA се виолетови, а контролните глувци се жолти. Главните компоненти 1 и 2 се прикажани на x-оската и y-оската, соодветно, и се изразени како нивен објаснет сооднос на варијанса.
Потоа го испитавме изобилството на KEGG нокаути во различни типови примероци. Идентификувани се вкупно 3648 уникатни нокаути, од кои 196 беа значително позастапени во контролните примероци, а 106 беа позастапени во PPA примероците (Слика 5). Вкупно 145 гени беа откриени во контролните примероци и 61 ген во PPA примероците, со значително различни изобилства. Патиштата поврзани со метаболизмот на липидите и аминошеќерите беа значително побогати во PPA примероците (Дополнителна табела 3). Патиштата поврзани со метаболизмот на азот и системите за релеј на сулфур беа значително побогати во контролните примероци (Дополнителна табела 3). Изобилството на гени поврзани со метаболизмот на аминошеќери/нуклеотиди (ko:K21279) и метаболизмот на инозитол фосфат (ko:K07291) беше значително поголемо во PPA примероците (Слика 5). Контролните примероци имаа значително повеќе гени поврзани со метаболизмот на бензоат (ko:K22270), метаболизмот на азот (ko:K00368) и гликолизата/глуконеогенезата (ko:K00131) (Слика 5).
Сл. 5. Диференцијална изобилство на KO во цревниот микробиом кај PPA и контролни глувци. Графиконот на вулканот ги прикажува разликите во изобилството на функционалните групи (KO). Сивите точки означуваат KO чие изобилство не било значително различно помеѓу типовите на примероци (p-вредност > 0,05). Обоените точки означуваат значајни разлики во изобилството (p-вредност ≤ 0,05). 20-те KO со најголеми разлики во изобилството помеѓу типовите на примероци се прикажани со црвена и светло сина боја, што одговара на контролните и PPA примероците, соодветно. Жолтите и виолетовите точки означуваат KO кои биле најмалку 2,7 пати позастапени во контролните и PPA примероците, соодветно. Црните точки означуваат KO со значително различни изобилства, со средни разлики во CLR помеѓу -1 и 1. P вредностите се пресметани со користење на Mann-Whitney U тестот и се прилагодени за повеќекратни споредби со користење на Benjamini-Hochberg постапката. NaN означува дека KO не припаѓа на патека во KEGG. Задебелените средни вредности на разликата во CLR означуваат значајни разлики во изобилството. За детални информации за патеките на кои припаѓаат наведените KO, видете ја Дополнителната табела 3.
Меѓу анотираните гени, 1601 гени имале значително различна застапеност помеѓу типовите на примероци (p ≤ 0,05), при што секој ген бил најмалку 2,7 пати позастапен. Од овие гени, 4 гени биле позастапени во контролните примероци, а 1597 гени биле позастапени во примероците на PPA. Бидејќи PPA има антимикробни својства, ги испитавме застапеностите на гените за метаболизам и производство на PPA помеѓу типовите на примероци. Меѓу 1332 гени поврзани со метаболизмот на PPA, 27 гени биле значително позастапени во контролните примероци, а 12 гени биле позастапени во примероците на PPA. Меѓу 223 гени поврзани со производството на PPA, 1 ген бил значително позастапен во примероците на PPA. Слика 6А дополнително ја покажува поголемата застапеност на гени вклучени во метаболизмот на PPA, со значително поголема застапеност во контролните примероци и големи димензии на ефектите, додека Слика 6Б ги истакнува индивидуалните гени со значително поголема застапеност забележана во примероците на PPA.
Сл. 6. Диференцијална изобилство на гени поврзани со PPA во микробиомот на цревата кај глувци. Вулканските графикони ги прикажуваат разликите во изобилството на гените поврзани со метаболизмот на PPA (A) и производството на PPA (B). Сивите точки означуваат гени чие изобилство не било значително различно помеѓу типовите на примероци (p-вредност > 0,05). Обоените точки означуваат значајни разлики во изобилството (p-вредност ≤ 0,05). 20-те гени со најголеми разлики во изобилството се прикажани во црвена и светло сина боја (контролни и PPA примероци), соодветно. Изобилството на жолти и виолетови точки било најмалку 2,7 пати поголемо во контролните и PPA примероците отколку во контролните примероци. Црните точки претставуваат гени со значително различни изобилства, со средни разлики во CLR помеѓу -1 и 1. P вредностите се пресметани со користење на Mann-Whitney U тестот и се коригирани за повеќекратни споредби со користење на Benjamini-Hochberg постапката. Гените одговараат на репрезентативни гени во нередундантниот каталог на гени. Имињата на гените се состојат од симболот KEGG што означува ген KO. Задебелените средни разлики во CLR означуваат значително различни изобилства. Цртичка (-) означува дека нема симбол за генот во базата на податоци KEGG.
Таксоните со гени поврзани со метаболизмот и/или производството на PPA беа идентификувани со споредување на таксономскиот идентитет на контигите со ID-то на контигот на генот. На ниво на род, кај 130 рода беа пронајдени гени поврзани со метаболизмот на PPA, а кај 61 род беа пронајдени гени поврзани со производството на PPA (Дополнителна табела 4). Сепак, ниту еден род не покажа значајни разлики во изобилството (p > 0,05).
На ниво на вид, кај 144 бактериски видови е утврдено дека имаат гени поврзани со метаболизмот на PPA, а кај 68 бактериски видови е утврдено дека имаат гени поврзани со производството на PPA (Дополнителна табела 5). Меѓу метаболизаторите на PPA, осум бактерии покажаа значително зголемување на изобилството помеѓу типовите на примероци и сите покажаа значајни промени во ефектот (Дополнителна табела 6). Сите идентификувани метаболизатори на PPA со значителни разлики во изобилството беа позастапени во примероците на PPA. Класификацијата на ниво на вид откри претставници на родови кои не се разликуваа значително помеѓу типовите на примероци, вклучувајќи неколку видови Bacteroides и Ruminococcus, како и Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus и Alcaligenes polymorpha. Меѓу бактериите што произведуваат PPA, четири бактерии покажаа значителни разлики во изобилството помеѓу типовите на примероци. Видовите со значителни разлики во изобилството вклучуваат Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis и Ruminococcus bovis.
Во оваа студија, ги испитавме ефектите од изложеноста на PPA врз цревната микробиота кај глувците. PPA може да предизвика различни реакции кај бактериите бидејќи го произведуваат одредени видови, го користат како извор на храна од други видови или има антимикробни ефекти. Затоа, неговото додавање во цревната средина преку додатоци во исхраната може да има различни ефекти во зависност од толеранцијата, подложноста и способноста да се користи како извор на хранливи материи. Чувствителните бактериски видови може да се елиминираат и заменат со оние кои се поотпорни на PPA или се способни да го користат како извор на храна, што доведува до промени во составот на цревната микробиота. Нашите резултати открија значителни разлики во микробниот состав, но нема ефект врз целокупната микробна разновидност. Најголемите ефекти беа забележани на ниво на вид, со над 70 таксони значително различни по изобилство помеѓу PPA и контролните примероци (Дополнителна табела 2). Понатамошната евалуација на составот на примероците изложени на PPA откри поголема хетерогеност на микробните видови во споредба со неекспонираните примероци, што укажува дека PPA може да ги подобри карактеристиките на бактерискиот раст и да ги ограничи бактериските популации кои можат да преживеат во средини богати со PPA. Така, PPA може селективно да предизвика промени, наместо да предизвика широко распространето нарушување на разновидноста на цревната микробиота.
Претходно е покажано дека конзервансите за храна, како што е PPA, ја менуваат изобилството на компонентите на цревниот микробиом без да влијаат на целокупната разновидност (Nagpal et al., 2021). Овде, ги забележавме највпечатливите разлики помеѓу видовите Bacteroidetes во рамките на филумот Bacteroidetes (порано познат како Bacteroidetes), кои беа значително збогатени кај глувци изложени на PPA. Зголемената изобилство на видовите Bacteroides е поврзана со зголемена деградација на слузта, што може да го зголеми ризикот од инфекција и да предизвика воспаление (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Една студија покажа дека неонаталните машки глувци третирани со Bacteroides fragilis покажуваат социјално однесување кое потсетува на нарушување на аутистичниот спектар (ASD) (Carmel et al., 2023), а други студии покажаа дека видовите Bacteroides можат да ја променат имунолошката активност и да доведат до автоимуна воспалителна кардиомиопатија (Gil-Cruz et al., 2019). Видовите што припаѓаат на родовите Ruminococcus, Prevotella и Parabacteroides исто така беа значително зголемени кај глувци изложени на PPA (Coretti et al., 2018). Одредени видови Ruminococcus се поврзани со болести како што е Кронова болест преку производство на проинфламаторни цитокини (Henke et al., 2019), додека видовите Prevotella како Prevotella humani се поврзани со метаболички заболувања како што се хипертензија и чувствителност на инсулин (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Конечно, откривме дека односот на Bacteroidetes (порано познати како Firmicutes) кон Bacteroidetes беше значително помал кај глувци изложени на PPA отколку кај контролните глувци поради поголемата вкупна изобилство на видови Bacteroidetes. Претходно е докажано дека овој сооднос е важен индикатор за цревната хомеостаза, а нарушувањата во овој сооднос се поврзани со разни болести (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), вклучувајќи воспалителни заболувања на цревата (Stojanov et al., 2020). Заедно, видовите од филумот Bacteroidetes се чини дека се најсилно погодени од покачена PPA во исхраната. Ова може да се должи на поголема толеранција на PPA или на способноста да се користи PPA како извор на енергија, што се покажа дека е точно за барем еден вид, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Алтернативно, изложеноста на мајчина PPA може да го подобри развојот на фетусот со тоа што цревата на потомството на глувци ќе бидат поподложни на колонизација од Bacteroidetes; сепак, нашиот дизајн на студијата не дозволи таква проценка.
Проценката на метагеномската содржина откри значајни разлики во изобилството на гени поврзани со метаболизмот и производството на PPA, при што глувците изложени на PPA покажаа поголемо изобилство на гени одговорни за производство на PPA, додека глувците кои не беа изложени на PPA покажаа поголемо изобилство на гени одговорни за метаболизмот на PAA (Слика 6). Овие резултати сугерираат дека ефектот на PPA врз микробниот состав можеби не се должи само на неговата употреба, во спротивно изобилството на гени поврзани со метаболизмот на PPA требаше да покаже поголемо изобилство во цревниот микробиом кај глувците изложени на PPA. Едно објаснување е дека PPA посредува во изобилството на бактерии првенствено преку неговите антимикробни ефекти, а не преку неговата употреба од страна на бактериите како хранлива материја. Претходните студии покажаа дека PPA го инхибира растот на Salmonella Typhimurium на начин зависен од дозата (Jacobson et al., 2018). Изложеноста на повисоки концентрации на PPA може да селектира бактерии кои се отпорни на неговите антимикробни својства и можеби не се нужно способни да го метаболизираат или произведуваат. На пример, неколку видови Parabacteroides покажаа значително поголема застапеност во примероците на PPA, но не беа откриени гени поврзани со метаболизмот или производството на PPA (Дополнителни табели 2, 4 и 5). Понатаму, производството на PPA како нуспроизвод на ферментација е широко распространето меѓу различни бактерии (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Поголемата бактериска разновидност може да биде причина за поголемата застапеност на гени поврзани со метаболизмот на PPA во контролните примероци (Averina et al., 2020). Понатаму, само 27 (2,14%) од 1332 гени се предвидени како гени поврзани исклучиво со метаболизмот на PPA. Многу гени поврзани со метаболизмот на PPA се вклучени и во други метаболички патишта. Ова дополнително покажува дека застапеноста на гени вклучени во метаболизмот на PPA била поголема во контролните примероци; овие гени може да функционираат во патишта што не резултираат со искористување или формирање на PPA како нуспроизвод. Во овој случај, само еден ген поврзан со генерирање на PPA покажа значајни разлики во застапеноста помеѓу типовите примероци. За разлика од гените поврзани со метаболизмот на PPA, маркерските гени за производство на PPA беа избрани бидејќи тие се директно вклучени во бактерискиот пат за производство на PPA. Кај глувци изложени на PPA, кај сите видови беше откриено дека имаат значително зголемена изобилство и капацитет за производство на PPA. Ова го поддржува предвидувањето дека PPA ќе ги изберат производителите на PPA и затоа предвидуваат дека капацитетот за производство на PPA ќе се зголеми. Сепак, изобилството на гени не мора нужно да корелира со генската експресија; затоа, иако изобилството на гени поврзани со метаболизмот на PPA е поголемо во контролните примероци, стапката на експресија може да биде различна (Shi et al., 2014). За да се потврди врската помеѓу преваленцата на гени што произведуваат PPA и производството на PPA, потребни се студии за експресијата на гените вклучени во производството на PPA.
Функционалната анотација на PPA и контролните метагеноми откри некои разлики. PCA анализата на содржината на гени откри дискретни кластери помеѓу PPA и контролните примероци (Слика 5). Групирањето во рамките на примерокот покажа дека содржината на контролните гени е поразновидна, додека примероците од PPA се групираат заедно. Групирањето според содржината на гени беше споредливо со групирањето според составот на видовите. Така, разликите во изобилството на патеките се конзистентни со промените во изобилството на специфични видови и соеви во нив. Во примероците од PPA, два патишта со значително поголемо изобилство беа поврзани со метаболизмот на аминошеќери/нуклеотидни шеќери (ko:K21279) и повеќекратни патишта на метаболизмот на липидите (ko:K00647, ko:K03801; Дополнителна табела 3). Гените поврзани со ko:K21279 се познати како поврзани со родот Bacteroides, еден од родовите со значително поголем број видови во примероците од PPA. Овој ензим може да го избегне имунолошкиот одговор со експресија на капсуларни полисахариди (Wang et al., 2008). Ова може да го објасни зголемувањето на Bacteroidetes забележано кај глувци изложени на PPA. Ова го надополнува зголеменото синтетизирање на масни киселини забележано во микробиомот на PPA. Бактериите го користат патот FASIIko:K00647 (fabB) за да произведат масни киселини, кои можат да влијаат на метаболичките патишта на домаќинот (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), а промените во метаболизмот на липидите може да играат улога во невроразвојот (Yu et al., 2020). Друг пат што покажува зголемена застапеност во примероците на PPA е биосинтезата на стероидни хормони (ko:K12343). Постојат сè повеќе докази дека постои инверзна врска помеѓу способноста на цревната микробиота да влијае на нивоата на хормони и да биде под влијание на хормоните, така што покачените нивоа на стероиди може да имаат последици по здравјето (Tetel et al., 2018).
Оваа студија не е без ограничувања и размислувања. Важна разлика е што не извршивме физиолошки проценки на животните. Затоа, не е можно директно да се заклучи дали промените во микробиомот се поврзани со некоја болест. Друга работа што треба да се земе предвид е дека глувците во оваа студија биле хранети со истата исхрана како и нивните мајки. Идните студии може да утврдат дали префрлањето од исхрана богата со PPA на исхрана без PPA ги подобрува нејзините ефекти врз микробиомот. Едно ограничување на нашата студија, како и на многу други, е ограничената големина на примерокот. Иако можат да се извлечат валидни заклучоци, поголема големина на примерокот би обезбедила поголема статистичка моќ при анализата на резултатите. Исто така, сме претпазливи во извлекувањето заклучоци за поврзаноста помеѓу промените во цревниот микробиом и која било болест (Yap et al., 2021). Збунувачки фактори, вклучувајќи ја возраста, полот и исхраната, можат значително да влијаат на составот на микроорганизмите. Овие фактори можат да ги објаснат недоследностите забележани во литературата во врска со поврзаноста на цревниот микробиом со сложени болести (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). На пример, е покажано дека членовите на родот Bacteroidetes се или зголемени или намалени кај животни и луѓе со ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Слично на тоа, студиите за составот на цревата кај пациенти со воспалителни заболувања на цревата откриле и зголемувања и намалувања кај истите таксони (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). За да го ограничиме влијанието на половата пристрасност, се обидовме да обезбедиме еднаква застапеност на половите, така што разликите најверојатно се предизвикани од исхраната. Еден предизвик на функционалната анотација е отстранувањето на непотребните генски секвенци. Нашиот метод на групирање на гени бара 95% идентитет на секвенцата и 85% сличност на должината, како и 90% покриеност на усогласувањето за да се елиминира лажното групирање. Сепак, во некои случаи, забележавме COG со исти анотации (на пр., MUT) (Сл. 6). Потребни се понатамошни студии за да се утврди дали овие ортолози се различни, поврзани со специфични родови или дали ова е ограничување на пристапот на групирање на гени. Друго ограничување на функционалната анотација е потенцијалната погрешна класификација; бактерискиот ген mmdA е познат ензим вклучен во синтезата на пропионат, но KEGG не го поврзува со метаболичкиот пат на пропионат. Спротивно на тоа, scpB и mmcD ортолози се поврзани. Големиот број гени без назначени нокаути може да резултира со неможност за идентификување на гени поврзани со PPA при проценка на изобилството на гени. Идните студии ќе имаат корист од анализата на метатранскриптомите, која може да обезбеди подлабоко разбирање на функционалните карактеристики на цревната микробиота и да ја поврзе генската експресија со потенцијалните ефекти од процесот. За студии кои вклучуваат специфични невроразвојни нарушувања или воспалителни заболувања на цревата, потребни се физиолошки и бихејвиорални проценки на животните за да се поврзат промените во составот на микробиомот со овие нарушувања. Дополнителни студии за трансплантација на цревниот микробиом кај глувци без микроби, исто така, би биле корисни за да се утврди дали микробиомот е двигател или карактеристика на болеста.
Накратко, покажавме дека PPA во исхраната делува како фактор во менувањето на составот на цревната микробиота. PPA е конзерванс одобрен од FDA, кој е широко распространет во разни видови храна и кој, по долготрајна изложеност, може да доведе до нарушување на нормалната цревна флора. Откривме промени во изобилството на неколку бактерии, што укажува дека PPA може да влијае на составот на цревната микробиота. Промените во микробиотата можат да доведат до промени во нивоата на одредени метаболички патишта, што може да доведе до физиолошки промени кои се релевантни за здравјето на домаќинот. Потребни се понатамошни студии за да се утврди дали ефектите на PPA во исхраната врз микробниот состав можат да доведат до дисбиоза или други болести. Оваа студија ги поставува темелите за идните студии за тоа како ефектите на PPA врз составот на цревата можат да влијаат на здравјето на луѓето.
Збирките податоци презентирани во оваа студија се достапни во онлајн репозиториуми. Името на репозиториумот и пристапниот број се: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Оваа студија на животни е одобрена од Комитетот за институционална грижа и употреба на животни при Универзитетот во Централна Флорида (UCF-IACUC) (број на дозвола за употреба на животни: PROTO202000002). Оваа студија е во согласност со локалните закони, прописи и институционални барања.
НГ: Концептуализација, Курирање на податоци, Формална анализа, Истражување, Методологија, Софтвер, Визуелизација, Пишување (оригинален нацрт), Пишување (преглед и уредување). ЛА: Концептуализација, Курирање на податоци, Методологија, Ресурси, Пишување (преглед и уредување). Ш: Формална анализа, Софтвер, Пишување (преглед и уредување). СА: Истражување, Пишување (преглед и уредување). Главен судија: Истражување, Пишување (преглед и уредување). СН: Концептуализација, Администрација на проект, Ресурси, Супервизија, Пишување (преглед и уредување). ТА: Концептуализација, Администрација на проект, Супервизија, Пишување (преглед и уредување).
Авторите изјавија дека не добиле никаква финансиска поддршка за истражувањето, авторството и/или објавувањето на овој напис.
Авторите изјавуваат дека истражувањето е спроведено во отсуство на какви било комерцијални или финансиски односи што би можеле да се протолкуваат како потенцијален судир на интереси. не е применливо.
Сите мислења изразени во овој напис се исклучиво мислења на авторите и не ги одразуваат нужно ставовите на нивните институции, издавачи, уредници или рецензенти. Производите оценети во овој напис, или тврдењата дадени од нивните производители, не се гарантирани или одобрени од издавачот.
Дополнителен материјал за оваа статија може да се најде онлајн: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абдели ЛС, Самсам А, Насер СА (2019). Пропионската киселина индуцира глиоза и невроинфламација преку регулирање на PTEN/AKT патеката кај нарушувања од аутистичниот спектар. Научни извештаи 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Ачисон, Ј. (1982). Статистичка анализа на композициските податоци. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Однос Firmicutes/Bacteroidetes како фактор на ризик за рак на дојка. Весник за клиничка медицина, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андерс С., Хубер В. (2010). Диференцијална експресиска анализа на податоци за броење на секвенци. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Анџелис, д-р, Пиколо, М., Ванини, Л., Сирагуса, С., Џакомо, АД, Серазанети, ДИ, и др. (2013). Фекална микробиота и метаболом кај деца со аутизам и первазивно развојно нарушување кое не е поинаку наведено. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверина ОВ, Ковтун АС, Пољакова СИ, Савилова АМ, Ребриков ДВ, Даниленко ВН (2020). Бактериски неврометаболни карактеристики на цревната микробиота кај мали деца со нарушувања од аутистичниот спектар. Весник за медицинска микробиологија 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Микробиомот како човечки орган. Клиничка микробиологија и инфекции 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баур Т., Дире П. (2023). Нови сознанија за физиологијата на бактериите што произведуваат пропионска киселина: Anaerotignum propionicum и Anaerotignum neopropionicum (порано Clostridium propionicum и Clostridium neopropionicum). Микроорганизми 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Исхрана на мајката и развој на фетусот. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Бенџамини, Ј. и Хохберг, Ј. (1995). Контролирање на стапката на лажно позитивни резултати: Практичен и ефикасен пристап кон повеќекратно тестирање. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Време на објавување: 18 април 2025 година