Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
За разлика од 'рбетниците, се смета дека инсектите немаат полови стероидни хормони пристрасни кон мажјаците. Кај Anopheles gambiae, екдизонскиот стероид 20-хидроксиекдизон (20E) се чини дека еволуирал за да го контролира развојот на јајцето кога се синтетизира од женки2 и да предизвика период на рефракторно парење кога се пренесува сексуално од мажјаци3. Бидејќи развојот на јајцето и парењето се основни репродуктивни особини, разбирањето како женските комарци Anopheles ги интегрираат овие хормонски сигнали би можело да го олесни дизајнирањето на нови програми за контрола на маларијата. Тука, откриваме дека овие репродуктивни функции се регулирани од различни полови стероиди преку комплексна мрежа на ензими што активираат/инактивираат екдистероиди. Идентификувавме специфичен оксидиран екдизон за мажјаци, 3-дехидро-20E (3D20E), кој го штити потеклото со исклучување на женската сексуална рецептивност по сексуалниот пренос и активирањето со дефосфорилација. Имено, трансферот на 3D20E, исто така, предизвика експресија на репродуктивни гени кои го одржуваат развојот на јајцето за време на инфекцијата со Plasmodium, обезбедувајќи го здравјето на заразените женки. 20E добиен од жена не предизвикува сексуална одговор, но им овозможува на единките за парење да положат јајца откако ќе се инхибираат 20E-инхибиторните кинази. Идентификацијата на овој машки специфичен стероиден хормон за инсекти и неговата улога во регулирањето на женската сексуална рецептивност, плодноста и интеракцијата со Plasmodium укажува на потенцијалот за намалување на репродуктивниот успех на комарците што пренесуваат маларија.
Случаите на маларија и смртните случаи повторно се во пораст4 поради широко распространетата отпорност на инсектициди кај комарците од родот Anopheles, единствениот вектор на човечки паразити на маларија. Биологијата на парење на овие комарци е особено привлечна цел за нови интервенции за контрола на маларијата бидејќи женките се парат само еднаш5; правењето на овој единствен настан на парење стерилен би имал голем потенцијал за намалување на популациите на комарци на терен.
Жените стануваат сексуално онеспособени откако ќе добијат стероидни хормони со висок титар од мажи. Студиите покажаа дека предизвикувачот за тешкотии во понатамошното парење е 20-хидроксиекдизон (20E), стероиден хормон попознат како регулатор на циклусот на митарење во ларвалната фаза. Способноста на мажјаците да синтетизираат и пренесуваат 20E еволуирала конкретно кај видовите Anopheles кои се дел од подродот Cellia7, кој е дистрибуиран во Африка и ги вклучува најопасните вектори на маларија, вклучувајќи го и Anopheles gambiae. Ова е особено значајно бидејќи кај овие видови женките исто така произведуваат 20E по секој крвен оброк, а 20E го движи циклусот на оогенеза (видете реф. 8). Сепак, малку се знае за начинот на кој женките интегрираат сигнали од два различни извори на екдизон (трансфер на мажјаци и индукција на хранење со крв) без да ја загрозат сопствената способност за парење. Всушност, ако 20E произведениот од женките предизвика сексуална нетолеранција, ова ќе доведе до неплодност кај индивидуи кои се хранат со девици, многу честа појава кај овие комарци5.
Можно објаснување е дека мажјаците од A. gambiae пренесуваат модифициран екдизон специфичен за мажјаците, кој активира сигнална каскада во женскиот репродуктивен тракт, што резултира со нестабилност при парење. Сепак, иако 'рбетниците имаат повеќе стероидни хормони, како што се естроген и андроген (прегледано во реф. 9), според нашите сознанија, стероиди пристрасни кон андрогените не се идентификувани кај инсектите.
Се стремиме да го одредиме репертоарот на стероидни хормони во машката машка помошна жлезда (MAG) на сексуално зрели A. gambiae во потрага по можни модифицирачки стероиди. Користејќи високо-перформансна течна хроматографија поврзана со тандемска масена спектрометрија (HPLC-MS/MS), наместо помалку специфичниот метод што се користеше претходно, откривме екдизон (E) и 20E во ова ткиво, потврдувајќи го претходниот резултат. Сепак, во примерокот доминираа оксидирани фосфорилирани стероиди, што е во согласност со формулата 3-дехидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 (Слика 1). Други форми вклучуваат 3-дехидро-20E (3D20E) и 20E-22-фосфат (20E22P). Интензитетот на HPLC-MS/MS сигналот на 3D20E22P беше два реда на големина повисок од неговата дефосфорилирана форма, 3D20E, и три реда на големина повисок од оној на E и 20E (Слика 1). Иако во другите делови од телото и долниот дел репродуктивен тракт (LRT; проширени податоци Сл. 1а). Исто така, анализиравме екдистероиди кај новозатворени (<1 ден стари) мажјаци и женки и откривме 3D20E и 3D20E22P само во MAG; E, 20E и 20E22P беа присутни кај двата пола (проширени податоци Сл. 1б). Овие податоци сугерираат дека возрасните мажјаци од A. gambiae произведуваат високи титри на модифицирачки хормони во нивните MAG кои не се синтетизираат од женките.
MAG и женски LRT (вклучувајќи преткомори, семенски везикули и паровариум) беа дисецирани од 4-дневни (4-дневни) девици мажјаци и девици и спарени женки (0,5, 3 и 12 hpm). Екдизонот во овие ткива беше анализиран со HPLC-MS/MS (средна вредност ± sem; неспарен t-тест, двострана, стапка на лажно откривање (FDR) корегирана; NS, не е значајно; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 часа наспроти 0,5 часа, P = 0,035; 12 часа наспроти 3 часа, P = 0,0015; 12 часа наспроти 0,5 часа, P = 0,030. 3D20E22P: 3 часа наспроти 0,5 часа, P = 0,25; 12 часа наспроти 3 часа, P = 0,0032; 12 часа наспроти 0,5 часа, P = 0,015). Податоците се од три биолошки реплики. Површината на пикот за секој екдизон од интерес е пресметана и нормализирана според бројот на комарци. Екдизонот е претставен со боја на следниов начин: E, зелена; 20E, портокалова; 20E22P, виолетова; 3D20E, сина; 3D20E22P, розова. Вметнатото ја зголемува скалата на y-оската за да ги прикаже пониските нивоа на екдизон.
За да испитаме дали 3D20E22P и 3D20E се пренесуваат за време на парењето, ги дисециравме женските LRT во различни временски точки по парењето. Иако екдизон не беше пронајден кај девиците, забележавме значителни количини на 3D20E22P во LRT веднаш по парењето (0,5 часа по парењето, hpm), намалувајќи се со текот на времето, додека нивоата на 3D20E значително се зголемија (Сл. 1). Користејќи хемиски синтетизиран 3D20E како стандард, утврдивме дека нивоата на овој стероиден хормон во LRT при парење беа најмалку 100 пати повисоки од 20E (Проширена табела со податоци 1). Така, 3D20E22P е главниот машки екдизон кој се пренесува на женскиот LRT за време на парењето, а неговата дефосфорилирана форма, 3D20E, станува многу изобилна кратко време по парењето. Ова укажува на важна улога за вториот екдизон во биологијата на женките по парењето.
Откако генериравме нов сет на податоци за секвенционирање на РНК (RNA-seq) (Сл. 2а), користејќи прилагоден биоинформатички цевковод, пребарувавме за екдизон киназа (EcK), екдизон оксидаза (EO) и екдизон што кодира 20E-модифициран ген за фосфатаза. EPP) е експресиран во репродуктивните ткива. Идентификувавме еден кандидат EPP ген и два потенцијални EcK гени (EcK1 и EcK2), но не можевме да најдеме добар кандидат EO ген. Имено, поединечните EPP гени беа експресирани на високи нивоа (98,9-ти перцентил) во гамбиските MAG, но не и кај женските LRT (Сл. 2б), спротивно на нашите очекувања бидејќи дефосфорилацијата на 3D20E22P се случи во ова женско ткиво. Затоа, веруваме дека машкиот EPP може да се пренесе за време на парењето. Всушност, користевме in vivo обележување со стабилни изотопи за да го маскираме женскиот протеин по парењето, ензим идентификуван со MS во женскиот атриум (Сл. 2в и Дополнителна табела 1). Присуството на EPP во MAG и спарена (но не девица) женка LRT беше потврдено и со употреба на специфични антитела (Сл. 2d).
a, Прилагодено изграден биоинформатички цевковод за пребарување на репродуктивните ткива на секој пол за гени што кодираат EcKs, EOs и EPPs. Броевите до стрелките го означуваат бројот на машки и женски кандидати во секој чекор. Оваа анализа идентификуваше еден EPP ген (EPP) и еден EcK ген (EcK1) кои се експресирани кај мажјаците, и еден EcK ген (EcK2) кој е експресиран кај двата пола, но не дава кандидат EO ген. b, Топлинска мапа што ја споредува експресијата на кандидат генот во девствени (V) и ткива за парење (M) од Anopheles gambiae и Anopheles albicans. Spca, оплодување; MAGs, помошни жлезди кај мажјаците; други делови од телото, вклучувајќи гради, крилја, нозе, масните тела и внатрешните органи кај двата пола и јајниците кај женките. EcK2 е високо изразен и во MAG и во преткоморите на Гамбија, додека EPP се наоѓа само во MAG. c, Протеомска анализа на транслокација на машката ејакулатна група во женски преткомори на 3, 12 и 24 hpm, покажувајќи ги 67-те најзастапени протеини. Женките биле одгледувани со исхрана што содржи 15N за обележување (и маскирање) на сите протеини. Необележаните мажјаци биле спарени со обележани женки, а женските LRT биле дисецирани на 3, 12 и 24 hpm за протеомска анализа (видете ја Дополнителната Табела 1 за комплетен список на ејакулаторни протеини). Вметнат, EPP, Eck1 и EcK2 биле откриени во MAG на девици мажјаци со протеомска анализа на овие ткива. d, EPP бил откриен со вестерн блот во MAG и LRT на спарени женки, но не кај девици женки или мажјаци или остатокот од женката. тело. Мембраните беа истовремено испитани со анти-актин (контрола на оптоварување) и анти-EPP антитела. Сите мажјаци се девици. Видете ја Дополнителната слика 1 за податоци од изворот на гел. Western blots беа извршени двапати со слични резултати.
Активноста на екдистероидната фосфофосфатаза на EPP беше потврдена по инкубација со HPLC-MS/MS со 3D20E22P изолиран од MAG (Проширени податоци Сл. 2a). Понатаму, кога го замолчивме EPP со РНК-посредувана интерференција (RNAi), откривме силно намалување на активноста на фосфатазата во репродуктивните ткива на овие мажјаци (Сл. 3a), а женките спарени со мажјаци замолчени со EPP покажаа значително помал процент на дефосфорилиран 3D20E (Сл. 3b) и покрај делумното замолчување на гените (Проширени податоци Сл. 2b,c). Спротивно на тоа, не откривме значајни промени во односот 20E22P/20E кај истите комарци, што може да сугерира дека ензимот е специфичен за 3D20E22P (Сл. 3b).
a, Намалена активност на фосфатазата во MAG предизвикана од замолчување на EPP со употреба на двоверижна EPP RNA (dsEPP) или двоверижна GFP RNA (dsGFP) контроли. Дваесет MAG групи беа користени во секоја реплика (P = 0,0046, спарен t-тест, двострано), претставени со посебни точки. b, Женките спарени со EPP-замолчени мажјаци имаа значително помал процент на дефосфорилиран 3D20E на 3 hpm (P = 0,0043, неспарен t-тест, двострано), додека нивоата на 20E беа непроменети (P = 0,063, неспарен). t-тест, двостран). Податоците се претставени како средна вредност ± сем од три групи од по 13, 16 и 19 женки. c, Женките спарени со мажјаци без EPP имале значително повисоки стапки на повторно спарување (P = 0,0002, Фишеров точен тест, двостран). Женките прво биле принудени да се спарат за да се обезбеди нивниот статус на парење; 2 дена подоцна, тие беа контактирани со други мажјаци кои носеа трансгена сперма за да се проценат стапките на повторно парење со квантитативна PCR детекција на трансгенот.d, Женките хранети со крв спарени со мажјаци замолчени со EPP имаа значително намалена плодност (P < 0,0001; Mann-Whitney тест, двостран) и малку намален број на јајца (P = 0,088, Mann-Whitney тест, двостран), додека стапката на мрестење не беше засегната (P = 0,94, Fisher-ов точен тест, двостран). Во сите панели, n го претставува бројот на биолошки независни примероци од комарци.NS, не е значајно.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Потоа, проценивме дали дефосфорилацијата на екдизон е важна за индуцирање на отпорност на парење кај женките. Имено, женките што се пареле со мажјаци со осиромашен EPP се препариле со многу поголема фреквенција (44,9%) отколку контролните женки (10,4%) кога биле изложени на дополнителни (трансгени) мажјаци (Сл. 3в). Исто така, забележавме значително намалување на плодноста (Сл. 3д, лево) и мало намалување на бројот на јајца положени од овие женки (Сл. 3д, во средина), додека процентот на јајца положени од женките (друг одговор предизвикан кај женките со парење)) не беше засегнат (Сл. 3д, десно). Со оглед на набљудуваната специфичност на EPP за 3D20E22P, овие резултати сугерираат дека активирањето на 3D20E од страна на EPP пренесен за време на парењето може да има важна улога во исклучувањето на рецептивноста на женките за понатамошно парење, однесување претходно припишувано на сексуалниот трансфер на 20E. Затоа, овој машки специфичен хормон, исто така, силно влијае на плодноста на женките.
Потоа, ги споредивме активностите на 20E и 3D20E во експерименти со инјектирање кај сексуално зрели девици користејќи хемиски синтетизиран 3D20E (Сл. 4a-c) и комерцијално достапен 20E. Забележавме дека 3D20E беше значително поефикасен од 20E во исклучување на чувствителноста на женките кон парење при обете концентрации (Сл. 4d). Имено, половина од физиолошкото ниво на 3D20E во LRT (1.066 pg по инјектирањето наспроти 2.022 pg по парењето) индуцираше дел од рефракторни женки што беше 20 пати повисок од физиолошкото ниво на 20E (361 pg по инјектирањето) 24 часа по инјектирањето при највисока концентрација од 18 pg по парењето; Табела со проширени податоци 1). Овој резултат е во согласност со идејата дека сексуалниот пренос на 20E не предизвикува рефракторни периоди на парење и дополнително укажува на 3D20E како главен фактор во обезбедувањето на односот родител-дете. 3D20E беше исто така значително поактивен од 20E во тестовите за положување јајца кај девици женки (Сл. 4e), што укажува дека нормалната стапка на положување јајца што ја забележавме по делумното замолчување на EPP се должи на присуството на резидуална активност на 3D20E што сè уште се произведува од женски фактори предизвикани од парењето.
(a,b) 3D20E хемиски синтетизиран од 20E (a) со многу висока конверзија/ефикасност (податоците се презентирани како средна вредност ± сем од три независни реакции на синтеза) (b).c, Масениот спектар (долната половина) точно се совпаѓа со екдизонот пронајден кај спарена женка LRT (горната половина).d, во споредба со 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Фишеров точен тест, двостран) и 10% етанол (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Фишеров точен тест, двостран), додека 20E беше значително повисок од контролата само при повисоки дози (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Фишеров точен тест, двостран).e, индуцирана со инјекција на 3D20E значително повисоки стапки на мрестење кај девиците женки отколку кај контролите со 10% етанол (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Фишеров точен тест, двостран), додека 20E во споредба со контролите Само при повисоки дози (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Фишеров точен тест, двостран).3D20E предизвика значително повисоки стапки на мрестење од 20E при повисоки дози (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Фишеров точен тест, двостран).Во сите панели, n го претставува бројот на биолошки независни примероци од комарци.NS, не е значајно.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.Податоците се од три реплицира.
Во претходните студии, утврдивме дека сексуалниот трансфер на стероидни хормони ја индуцира експресијата на MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), женски репродуктивен ген кој ги штити женките од A. gambiae од инфекција со P. falciparum. Здравствени трошоци предизвикани од 13, најсмртоносниот човечки паразит на маларија. Со оглед на важноста на MISO за репродуктивната способност на Anopheles во областите ендемични за маларија, решивме да утврдиме кој хормон 3D20E или 20E ја активира експресијата на овој ген. Откривме дека додека инјекцијата на 20E специфично или посилно индуцира некои нуклеарни хормонски рецептори (HR), како што се HR3 и HR4, и типични стероидни цели низводно, како што се јологените гени Vg14, 15, 16, MISO беше посилно индуциран од 3D20E (Проширени податоци Сл. 3). Така, сексуалниот трансфер на овој андроген стероиден хормон се чини дека индуцира механизми кои ги штитат женките од трошоците предизвикани од паразитска инфекција. Понатаму, 3D20E диференцијално влијае на обете изоформи. на E рецепторот EcR, индуцирајќи го EcR-A и потиснувајќи го EcR-B, и посилно активирајќи други гени што индуцираат парење, вклучувајќи го и HPX15, што влијае на плодноста кај жените. Ова би можело да го објасни значајниот неплодност забележан кај женките спарени со мажјаци со EPP-замолчени (Проширени податоци Сл. 3). Овие податоци укажуваат на постоење на низводни патишта преференцијално активирани од два екдизонски хормони кои можат да бидат основа на полово-специфичната функција.
Потоа, ја тестиравме функцијата на двата EcK гена идентификувани во нашиот биоинформатички процес. Замолчувањето на EcK1 или EcK2 резултираше со значителен морталитет кај мажите (Проширени податоци Сл. 4а), што укажува дека фосфорилацијата на екдизон, а со тоа и инактивацијата, е важна за преживување. Бидејќи EcK2 беше експресиран на повисоки нивоа од EcK1 и беше откриен во MAG со протеомика (Сл. 2б, в и Дополнителна табела 2), ја потврдивме неговата активност на екдистероидна киназа со инкубирање со 20E, што резултираше со фосфорилација на 20E22P (Проширени податоци Слика 2).4б). Кога користевме 3D20E како супстрат, не можевме да го детектираме фосфорилираниот производ 3D20E22P (Проширени податоци Сл. 4в), што укажува дека 20E, а не 3D20E, може да биде претпочитаната цел на EcK2.
Според нашата RNA-seq анализа, EcK2 беше исто така високо експресиран во LRT кај девици женки, каде што беше исклучен по парењето (сл. 2б). Ги потврдивме овие податоци и утврдивме дека експресијата на EcK2 не е засегната од хранењето со крв (Проширени податоци сл. 5а). Проширувајќи ги нашите почетни MS експерименти, утврдивме дека врвот на 20E22P е тесно поврзан со врвот на 20E (22-26 часа по крвен оброк; Проширени податоци сл. 5б). Замолчувањето на EcK2 кај девици женки резултираше со 3-кратно зголемување на релативниот однос на 20E кон 20E22P на 26 часа по крвен оброк (Проширени податоци слики 2в и 5в), потврдувајќи дека EcK2 исто така го фосфорилира 20E кај женките. Имено, девиците со намален EcK2 одржуваа целосна сексуална рецептивност (Проширени податоци сл. 5д,е), што дополнително сугерира дека производството на 20E кај женките не предизвикува рефракторни периоди на парење. Сепак, овие женки имале значително зголемени стапки на положување јајца во споредба со контролните групи, при што повеќе од 30% од девиците положувале јајца (Проширени податоци Сл. 5f). Доколку инјекциите со двоверижна Eck2 РНК (dsEcK2) биле извршени по хранење со крв, не се случило мрестење, при што врвот на 20E поради внесувањето крв се намалил. Генерално, овие резултати поддржуваат модел дека 20E произведен по цицање крв може да предизвика мрестење, но само кога блокот на мрестење (EcK2 и евентуално други фактори) е исклучен со парење. Ниту инјекциите со 20E ниту 3D20E не ја инхибирале експресијата на EcK2 кај девиците (Проширени податоци Сл. 5g), што укажува дека други фактори посредуваат во инхибицијата на оваа киназа. Сепак, нивоата на 20E по хранење со крв не биле доволни за да предизвикаат непријатност при парење, туку биле ефикасно предизвикани од високи титри на сексуално пренесен 3D20E.
Нашите резултати даваат важен увид во механизмите што го регулираат репродуктивниот успех на A. gambiae. Се појави модел каде што мажјаците еволуирале за да синтетизираат високи титри на 3D20E, модифициран екдизон специфичен за мажјаците, кој обезбедува потекло со десензитизација на женките за понатамошно парење. Во исто време, овие вектори на маларија, исто така, развиле ефикасен систем за активирање на 3D20E кај женките како одговор на сексуалниот трансфер на EPP специфичен за мажјаците. Според нашите сознанија, ова е првиот пример за систем на стероидни хормони доминиран од мажјаци и жени, кој извршува единствена и критична функција кај инсектите. Функцијата на екдизон специфична за мажјаците е постулирана, но не е дефинитивно демонстрирана. На пример, во голема мера побиена хипотеза 18 е дека овие функции може да ги извршува претходникот на 20E E1. Добро е познато дека кај Drosophila, монандријата е предизвикана од сексуалниот трансфер на мали полови пептиди 19,20 кои комуницираат со невроните што го инервираат женскиот репродуктивен тракт преку специфични рецептори за полови пептиди 21,22. Потребна е понатамошна работа за да се утврди низводниот тек. сигнални каскади контролирани од 3D20E кај женките од A. gambiae и да се утврди дали овие каскади можат да се зачуваат помеѓу комарците и Drosophila.
Со оглед на важната улога на 3D20E врз плодноста и однесувањето на женките идентификувани во нашата студија, патиштата што водат до синтеза и активирање на 3D20E нудат нови можности за идни стратегии за контрола на комарци, како што е генерирање на конкурентни стерилни мажјаци во стратегии за стерилна технологија на инсекти. Употреба за диво ослободување или за имитирање на 3D20E во девствена игра. Специфичната функција на 3D20E за мажјаците можеби еволуирала кога A. gambiae и другите видови Cellia ја стекнале способноста да ја коагулираат својата сперма во приклучоци за парење, бидејќи тоа овозможува ефикасен трансфер на голем број хормони и ензими што ги активираат хормоните. За возврат, еволуцијата на 3D20E што ја имплементира монандријата обезбедува механизам за женките (преку висока експресија на MISO) да ја фаворизираат нивната репродуктивна способност во области со висока преваленца на маларија, што индиректно придонесува за пренос на Plasmodium. Со оглед на тоа што е покажано дека женката 20E има длабоки ефекти врз преживувањето и растот на P. falciparum кај женските комарци Anopheles,24 и машките и женските патеки на стероидни хормони сега се клучни аспекти на интеракциите комарец-паразит.
Соевите A. gambiae G3 беа одгледувани под стандардни услови за инсекти (26-28 °C, релативна влажност 65-80%, фотопериод од 12:12 часа светло/темно). Ларвите беа хранети со прашкаста храна за риби (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets и Tetra Pond Sticks во сооднос 7:7:2). Возрасните комарци беа хранети ad libitum со 10% раствор на декстроза и неделно човечка крв (компоненти на крв за истражување). Девствените комарци беа добиени со сегрегација на половите во фаза на кукла по испитување на краевите со микроскопија. Мажјаците што го носат трансгенот DsRed се опишани претходно.
Експериментите со принудно парење беа извршени според претходно опишаните протоколи. За природно парење, 4-дневни девици женки беа чувани во сооднос 1:3 со сексуално зрели девици мажјаци две ноќи. За експериментите во кои на мажјаците им беше инјектиран dsEPP, ко-згрижувањето се совпадна со 3-4 дена по инјектирањето, кога активноста на фосфатазата беше максимално замолчена (Проширени податоци Сл. 2б).
Ткивата од комарци, преостанатите трупови (остатокот од телото) или целото тело беа дисецирани во 100% метанол и хомогенизирани со перли (стаклени перли од 2 mm, 2.400 вртежи во минута, 90 сек). Количините на ткивата и волумените на метанол беа следниве: остаток од телото, 50 во 1.000 µl; MAG, 50–100 80 µl; женски LRT, 25–50 80 µl. Талогот беше подложен на втора екстракција со метанол со ист волумен на метанол. Клеточните остатоци беа отстранети со центрифугирање. Метанолот од двете екстракции беше комбиниран и сушен под проток на азот, а потоа ресуспендиран во следните волумени од 80% метанол во вода: остаток од телото, 50 µl; MAG и женски LRT, 30 µl.
Примероците беа анализирани на масен спектрометар (ID-X, Thermo Fisher) поврзан со LC инструмент (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl од примерокот беше инјектиран во колона од 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) одржувана на 25 °C. Мобилните фази за LC беа A (вода, 0,1% мравја киселина) и B (ацетонитрил, 0,1% мравја киселина). LC градиентот беше како што следува: 5% B за 1 минута, потоа зголемено на 100% B во текот на 11 минути. По 8 минути на 100%, повторно изедначете ја колоната на 5% B за 4 минути. Брзината на проток беше 0,3 ml min-1. Јонизацијата во MS изворот се постигнува со јонизација со загреан електроспреј во позитивен и негативен режим.
Масениот спектрометар мери податоци во m/z опсег од 350 до 680 при резолуција од 60.000 во целосен MS режим. MS/MS податоците се добиени на [M + H]+ (сите цели), [M - H2O + H]+ (сите цели) и [M - H]- (фосфорилирани цели). MS/MS податоците се користени за да се потврдат својствата на екдизонот на целите за кои не е достапен стандард. За да се идентификуваат нецелните екдистероиди, анализирани се MS/MS податоците за сите HPLC врвови со релативна застапеност >15%. Квантифицирајте со користење на стандардни криви создадени од чисти стандарди (20E, 3D20E) за да се пресметаат апсолутните количини или разредувањата на еден специфичен примерок (сите други цели) за да се пресмета нивната еквивалентност со количините пронајдени кај еден мажјак. За 3D20E, квантификацијата е извршена со користење на збирот на следните адукти: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Податоците беа извлечени и квантифицирани со помош на Tracefinder (верзија 4.1). MS/MS податоците беа анализирани со помош на Xcalibur (верзија 4.4). MS спектрите на E, 20E и 3D20E беа споредени со соодветните стандарди. 3D20E22P беше анализиран со дериватизација со Жираров реагенс. 20E22P беше анализиран со m/z сооднос.
3D20E22P беше прочистен од MAG. Прочистувањето беше извршено на аналитичка скала со употреба на ултра-перформансен течен хроматограф (Acquity, Waters) со квадрополен детектор базиран на маса (QDa, Acquity, Waters) под истите LC услови како и HPLC-MS/MS анализата. Собирањето на фракции беше активирано кога m/z што одговара на 3D20E22P беше детектирано во исто време на задржување како што беше претходно определено. Чистотата на екстрахираните соединенија потоа беше проверена со HPLC-MS/MS како што е опишано погоре.
Вкупната РНК беше екстрахирана од 10-12 репродуктивни ткива или други делови од телото (без глава) со користење на TRI реагенс (Thermo Fisher) според упатствата на производителот. РНК беше третирана со TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA беше синтетизирана со користење на обратна транскриптаза на вирусот на глувчешка леукемија Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) според упатствата на производителот. Прајмери ​​за квантитативна PCR со обратна транскрипција (RT-qPCR; Extended Data Table 2) беа претходно објавени24 или дизајнирани со користење на Primer-BLAST26, со предност дадена на производи со големина од 70-150 bp и опфаќање на споеви ексон-ексон или прајмери ​​за пар прајмери ​​кои ги одделуваат екзоните. Примероците од cDNA од три до четири биолошки реплики беа разредени четири пати во вода за RT-qPCR. Квантификацијата беше извршена во 15 µl репликативни реакции што содржат 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), прајмери ​​и 5 µl разредена cDNA. Реакциите беа извршени на QuantStudio. 6 Pro систем за PCR во реално време (Thermo Fisher) и податоците беа собрани и анализирани со користење на Дизајн и анализа (верзија 2.4.3). Како што е прикажано во оваа студија, релативните количини беа нормализирани на рибозомскиот ген RpL19 (AGAP004422), чија експресија не се промени значително со хранење со крв 27 или парење 3.
Квалитетот на РНК беше проверен со помош на Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Библиотеките со парни краеви Illumina беа подготвени и извршени во Институтот Броуд на МИТ и Харвард. Читањата на секвенционирањето беа усогласени со геномот на A. gambiae (сој PEST, верзија 4.12) со помош на HISAT2 (верзија 2.0.5) со стандардни параметри. Читањата со резултати за квалитет на мапирање (MAPQ) <30 беа отстранети со помош на Samtools (верзија 1.3.1). Бројот на читања мапирани на гени беше изброен со помош на htseq-count (верзија 0.9.1) со стандардни параметри. Нормализираните броеви на читања беа пресметани и диференцијалната генска експресија беше анализирана со помош на пакетот DESeq2 (верзија 1.28.1) во R (верзија 4.0.3).
Кандидатите за гени што го модифицираат екдизонот беа идентификувани со прво пребарување на геномот на A. gambiae користејќи го алгоритмот PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), користејќи ги стандардните вредности на параметрите со следните протеински секвенци на барањето: од Bombyx mori (пристапен број NP_001038956.1), Musca domestica (пристапен број XP_005182020.1, XP_005175332.1 и XP_011294434.1) и Microplitis demolitor (пристапен број XP_008552646.1 и XP_008552645.1) EcK од B. mori (пристапен број NP_001036900), Drosophila melanogaster (пристапен број NP_651202), Apis mellifera (пристапен број XP_394838) и Acyrthosiphon pisum (пристапен број XP_001947166); и EPP од B. mori (пристапен број XP_001947166) NP_001177919.1 и NP_001243996.1) и EO од D. melanogaster (пристапен број NP_572986.1) (чекор 1). Потоа, филтрирањето се врши врз основа на висока експресија на mRNA (>100 фрагменти/килобазни ексони на милион мапирани читања (FPKM) или >85%) во репродуктивно ткиво (женска LRT или MAG) во Гамбија (чекор 2). За да ја подобриме специфичноста, избравме кандидат ензими кои се експресираат и во репродуктивното ткиво на A. albimanus, вид анофел кој не синтетизира ниту пренесува екдизон за време на парењето. Кандидатските гени беа филтрирани врз основа на ниска експресија (<100 FPKM или <85-ти перцентил) во репродуктивното ткиво на A. albimanus (чекор 3). Како последен филтер (чекор 4), кандидатските гени треба да задоволат барем едно од следниве: (1) значително зголемена регулација по парењето (P < 0,05) според анализата на диференцијално експресирани гени и (2) во нерепродуктивни ткива (< 85% или <100 FPKM).
Ги модифициравме претходно опишаните методи 28,29,30 за да постигнеме изотопско обележување на целиот организам. Накратко, дивиот тип Saccharomyces cerevisiae тип II (YSC2, Sigma) беше тестиран во азотна база на квасец (BD Difco, DF0335) што содржи (тежина/вол.) 2% гликоза (G7528, Sigma), 1,7% без аминокиселини и амониум сулфат (средина за култура) и 5% 15N амониум сулфат (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) како единствен извор на азот. Квасецот беше собран со центрифугирање, а ларвите од комарци беа хранети ad libitum до пупација. Дополнете со рибино брашно (0,5 mg на 300 ларви) за да се спречи смртност во четвртиот инстар. Потоа беа користени само женки во експерименти за парење со необележани мажјаци за да се анализира машкиот протеом пренесен за време на парењето.
Женките девствени единки, стари 4-6 дена, обележани со 15N, беа принудени да се парат со мажјаци девствени единки со иста возраст, необележани. Успешното парење беше потврдено со откривање на приклучоци за парење под епифлуоресцентна микроскопија. На 3, 12 и 24 hpm, преткоморите на 45-55 спарени женки беа дисецирани во 50 µl пуфер од амониум бикарбонат (pH 7,8) и хомогенизирани со толчник. Хомогенатот беше центрифугиран, а супернатантот се измеша со 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) во 50 mM амониум бикарбонат. Супернатантот и пелетот од секој примерок беа брзо замрзнати на сув мраз и испратени преку ноќ во лабораторијата MacCoss на Универзитетот во Вашингтон, каде што беше завршена подготовката на примерокот за LC-MS/MS. Ресуспендирајте го пелетот во 50 µl 0,1% RapiGest во 50 mM амониум бикарбонат и соникирајте во водена бања. Концентрацијата на протеини во пелетот и супернатантот беше измерена со BCA анализа, примероците беа редуцирани со 5 mM дитиотреитол (DTT; Sigma), алкилирани со 15 mM јодоацетамид (Sigma) и инкубирани на 37 °C (1:0 50) 1 час со трипсинизација: однос трипсин:супстрат). RapiGest беше лизиран со додавање на 200 mM HCl, проследено со инкубација на 37 °C 45 минути и центрифугирање на 14.000 вртежи во минута 10 минути на 4 °C за да се отстранат остатоците. Примероците беа измиени со двоен режим на екстракција во цврста фаза (Oasis MCX кертриџи, Waters) и ресуспендирани во 0,1% мравја киселина за конечна концентрација на протеини од 0,33 µg µl-1. Необележаните MAG протеоми беа слично анализирани од девици мажјаци. Две аналитички реплики беа анализирани за секој примерок. Потоа, беше анализирано 1 µg од секој. користејќи колона од 75 μm од фузиран силициум диоксид од 25 cm со фрит-стапица Kasil1 (PQ) од 4 cm спакувана со обратнофазна смола Jupiter C12 (Phenomenex) и 180-минутна течна хроматографија. Дигестии на примероци – MS/MS беше извршена на Q-Exactive HF масен спектрометар (Thermo Fisher) со nanoACQUITY UPLC систем (Waters). Податоците поврзани со аквизицијата на податоци генерирани за секое извршување беа конвертирани во mzML формат користејќи Proteowizard (верзија 3.0.20287) и користејќи Comet31 (верзија 3.2) во базата на податоци FASTA што содржи протеински секвенци од Anopheles gambiae (VectorBase верзија 54), Anopheles coluzzi. Пребарувањето беше извршено на Mali-NIH (VectorBase верзија 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, март 2021), A. gambiae RNA-seq и преводи во три рамки на познати човечки загадувачи. FDR-ите што се совпаѓаат со пептидна мапа беа одредени користејќи Percolator32 (верзија 3.05) со праг од 0,01, а пептидите беа собрани во идентификации на протеини користејќи штедливост на протеини во Limelight33 (верзија 2.2.0). Релативната изобилство на протеини беше проценета со користење на нормализираниот спектрален фактор на изобилство (NSAF) пресметан за секој протеин во секое тестирање како што е претходно опишано. NSAF во однос на секој протеин беше просечен низ примероците од две различни биолошки реплики. Обележувањето со 15N успешно го маскира женскиот протеом, иако мала количина на необележан протеин можеше да се открие од обележаните девици. Евидентиравме откривање на намалување на машкиот протеин (1-5 спектри) кај женските сурови примероци само во технички тестирања, каде што суровите примероци беа тестирани по машките/примероци за парење, како резултат на HPLC „пренесување“. Повремените протеини пронајдени како „загадувачи“ од обележани девици се наведени во Дополнителната табела 1.
Два антигенски пептиди, QTTDRVAPAPDQQQ (во рамките на изотипот PA) и MESDGTTPSGDSEQ (во рамките на изотипот PA и PB) во Genscript. Двата пептиди беа комбинирани, потоа конјугирани со протеинот-носач KLH и инјектирани во новозеландски зајаци. Зајаците беа жртвувани по четвртата инјекција, а вкупниот IgG беше изолиран со афинитетно прочистување. IgG од најспецифичниот зајак за EPP беше користен за понатамошно вестерн блотирање.
За вестерн блот, MAG (n = 10, каде што n го претставува бројот на биолошки независни примероци од комарци) и женски LRT (n = 30) од 4-дневни девици мажјаци и девици или присилно спарени женки (<10 по спарувањето), посебно беше додаден протеински пуфер за екстракција (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% натриум деоксихолат; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× коктел од инхибитори на протеаза (Roche)). Примероците беа хомогенизирани веднаш по дисекцијата со зрна (стаклени зрна од 2 mm, 2.400 вртежи во минута, 90 сек). Нерастворливите остатоци беа отстранети со центрифугирање на 20.000 g на 4 °C. Протеините беа квантифицирани со Bradford тест (Bio-Rad). Потоа, беа земени 20 µg MAG протеин, 40 µg LRT протеин и 20 µg резидуален протеин. денатурирани и одделени со 10% Bis-Tris NuPAGE користејќи MOPS пуфер. Протеините беа пренесени во мембрани со поливинилиден флуорид користејќи го системот за пренос iBlot2 (Thermo Fisher). Мембраните беа измиени двапати во 1× PBS-T (0,1% Tween-20 во PBS), а потоа блокирани во блокирачки пуфер Odyssey (Li-Cor) 1 час на 22°C. Мембраните беа протресени преку ноќ на 4°C со прилагодено поликлонално примарно антитело против зајак анти-EPP (1:700 во блокирачки пуфер) и моноклонално примарно антитело против стаорец MAC237 (Abeam; 1:4,000). Мембраните беа измиени со PBS-T, а потоа инкубирани со секундарни антитела (магарешки анти-зајак 800CW и козји анти-стаорец 680LT (Li-Cor), обете 1:20,000) во блокирачки пуфер што содржи 0,01% SDS и 0,2% Tween-20 за 1 час на 22 °C. Мембраните беа измиени со PBS-T и сликани со скенер Odyssey CLx. Сликите беа собрани и обработени во Image Studio (верзија 5.2). Не беше детектиран специфичен опсег што одговара на изоформата EPP-RA (82 kDa).
Кодирачките региони на EPP (како изоформа AGAP002463-RB што содржи домен на хистидин фосфатаза, NCBI конзервиран домен пребарување 34) и EcK2 (AGAP002181) беа клонирани во плазмидот pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Прајмерите се наведени во Табела 2 со проширени податоци. Осум GS4 линкери (во тандем) беа вметнати пред C-терминалната 6xHis ознака на конструкцијата pET-21a(+)-EcK2. Рекомбинантните протеини беа произведени со помош на реакцијата на синтеза на протеини од E. coli без клетки NEBExpress (New England BioLabs). Рекомбинантните протеини беа прочистени со помош на спин колони NEBExpress Ni (New England BioLabs). Контролниот протеин на дихидрофолат редуктаза (DHFR) беше произведен со помош на ДНК шаблон од комплетот за синтеза на протеини од E. coli без клетки NEBExpress. Протеините беа складирани во 50% глицерол во PBS на -20 °C до 3 месеци.
Фосфатазната активност на EPP и ткивни екстракти беше измерена со употреба на 4-нитрофенил фосфат (pNPP; Sigma-Aldrich). Реакцискиот пуфер содржеше 25 mM Tris, 50 mM оцетна киселина, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA и 1 mM DTT. Ткивото беше хомогенизирано во реакциски пуфер, а клеточните остатоци беа отстранети со центрифугирање. Реакцијата започна со додавање на ензим или ткивен екстракт во реакциски пуфер што содржи 2,5 mg ml-1 pNPP. Реакциската смеса беше инкубирана на собна температура во темница, а количината на pNP конвертирана од pNPP беше квантифицирана со мерење на апсорпцијата на 405 nm во различни времиња.
За in vitro EcK активност, протеинот беше инкубиран со 0,2 mg 20E или 3D20E во 200 µl пуфер (pH 7,5) што содржи 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP и 10 mM MgCl2 во тек на 2 часа на 27 °C. Реакцијата беше запрена со додавање на 800 µl метанол, потоа се олади на -20 °C во тек на 1 час, а потоа се центрифугираше на 20.000 g во тек на 10 минути на 4 °C. Супернатантот потоа беше анализиран со HPLC-MS/MS. За да се инактивираат со топлина протеините што се користеа во контролната група, протеините беа инкубирани во 50% глицерол во PBS во тек на 20 минути на 95 °C.
За in vitro EPP активност, протеинот беше инкубиран со 3D20E22P (еквивалентно на количината пронајдена во 18 пара MAG, прочистени со HPLC-MS/MS) во 100 µl пуфер (pH 7,5) што содржи 25 mM Tris, 50 mM оцетна киселина, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA и 1 mM DTT во тек на 3 часа на 27 °C. Реакцијата беше запрена со додавање на 400 µl метанол и оладена на -20 °C во тек на 1 час, а потоа центрифугирана на 20.000 g во тек на 10 минути на 4 °C. Супернатантот беше анализиран со HPLC-MS/MS.
PCR фрагментите за EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) и EcK2 (556 bp) беа амплифицирани од cDNA подготвена од кадавери од комарци без глава од мешан пол. PCR фрагментот од контролата eGFP (495 bp) беше амплифициран од претходно опишаниот pCR2.1-eGFP; PCR прајмерите се наведени во Табела со проширени податоци 2. PCR фрагментот беше вметнат помеѓу инвертираните T7 промотори на плазмидот pL4440. Плазмидните конструкции беа земени од NEB 5-α компетентната E. coli (New England Biolabs) и потврдени со секвенционирање на ДНК пред употреба (видете Дополнителни податоци 1 за секвенцата на вметнување). Прајмерите што се совпаѓаат со T7 промотерот (Табела со проширени податоци 2) беа користени за амплификација на вметнувањето од плазмидот базиран на pL4440. Големината на PCR производот беше потврдена со електрофореза на агарозен гел. dsRNA беше транскрибирана од PCR шаблони со користење на комплетот за транскрипција Megascript T7 (Thermo Fisher) и прочистена според упатствата на производителот со претходно опишаните модификации.
За инјектирање на dsRNA, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) беше инјектирана со концентрација од 10 ng nl-1 во градниот кош на возрасни мажјаци или женки (Nanoject III, Drummond) во рок од 1 ден по еклозијата. Нивоата на нокаутирање на гени беа утврдени во најмалку три биолошки реплики со екстракција на РНК, синтеза на кДНК и RT-qPCR. За инјектирање на екдизон, на 4-дневни девици или 6-дневни девици хранети со крв им беа инјектирани 0,13, 0,21 или 0,63 µg 20E или 3D20E (Nanoject III, Drummond) во концентрации од 1,3, 2,1, соодветно, во зависност од експерименталниот дизајн или 6,3 ng nl-1. Инјектирајте 100 nl 10% (vol/vol) етанол во вода; 100 nl 3D20E22P во 10% етанол (еквивалентно на 75% од количината пронајдена во пар MAG). Комарците беа случајно распределени во групата за инјектирање.
За тестови за мрестење, женките стари 3 дена биле хранети ad libitum со човечка крв. Отстранете ги делумно нахранетите или ненахранетите комарци. Во зависност од третманот, женките биле сместени во посебни чаши за мрестење четири ноќи најмалку 48 часа по крвниот оброк. Јајцата биле броени под стереоскоп (Stemi 508, Zeiss); за спарените женки, јајцата од кои се извеле ларви се сметале за плодни.
За испитувањата за парење, на женките им беше дозволено најмалку 2 дена, во зависност од третманот, да развијат отпорност на парење, а мажјаците од див тип со иста возраст беа последователно внесени во истиот кафез. Две ноќи подоцна, женските оплодени везикули беа дисецирани и геномската ДНК беше ослободена со замрзнување-одмрзнување и соникација во пуфер што содржи 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA и 25 mM NaCl (pH 8,2). Примероците беа инкубирани со Протеиназа К (0,86 µg µl-1) 15 минути на 55 °C, а потоа 10 минути на 95 °C. Препаратите од сурова геномска ДНК беа разредени 10 пати и подложени на qPCR детекција на секвенците на Y хромозомот; прајмерите се наведени во Табела со проширени податоци 2. Отсуството на секвенца на Y хромозомот укажува на отсуство на парење.
За тестови за повторно парење, присилно спарените женки беа испитани за присуство на приклучоци за парење за да се потврди статусот на парење и им беше дозволено 2 дена да развијат рефракторност на парење во отсуство на мажјаци, како што беше претходно опишано 36. Мажјаците што носеа DsRed трансгени сперматозоиди потоа беа внесени во женски кафези. Две ноќи подоцна, везикулите за оплодување беа дисецирани од женките, а геномската ДНК беше подготвена како што е опишано погоре и подложена на qPCR детекција на DsRed трансгенот; прајмерите се наведени во Табела со проширени податоци 2. Отсуството на DsRed трансгенот укажуваше дека не се случило повторно парење.
3D20E беше синтетизиран како што беше претходно опишано 37. Накратко, 10 mg од 20E (Sigma-Aldrich) беа растворени во 10 ml вода, по што следеше додавање на 30 mg платина црна (во форма на прав, Sigma-Aldrich). Нежен млаз од O2 континуирано се вбризгуваше во реакционата смеса, која се мешаше на собна температура. По 6 часа, беа додадени 30 mL метанол за да се запре реакцијата. Смесата беше центрифугирана за да се отстранат честичките од катализаторот. Супернатантот беше испарен до сувост во вакуум на собна температура. Сувиот реакционен производ беше растворен во 10% етанол и метанол за инјектирање за HPLC-MS/MS анализа. Стапката на конверзија (од 20E до 3D20E) беше приближно 97% (Сл. 4b), а MS спектарот на синтетизираниот 3D20E се совпаѓаше со оној пронајден кај спарени женки (Сл. 4c).
Легендата содржи специфични детали за извршените статистички тестови. GraphPad (верзија 9.0) беше користен за извршување на точниот тест на Фишер, тестот Мантел-Кокс и t-тестот на Студент. Тестовите Кокран-Мантел-Хенсел беа извршени со помош на прилагодена R скрипта (достапна на https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Распределбата на податоците беше тестирана за нормалност со помош на тестот Шапиро-Вилк со праг на значајност од 0,05. Кога податоците не го поминаа тестот за нормалност, беше извршен тестот Ман-Витни. Податоците за преживување беа анализирани со помош на тестот Мантел-Кокс. Пакетот DESeq2 (верзија 1.28.1) беше користен за извршување на анализа на диференцијална експресија на ниво на ген RNA-seq. Хоризонталната лента на графиконот ја претставува медијаната. Вредност на значајност од P = 0,05 беше користена како праг за сите тестови.
За повеќе информации за дизајнот на студијата, видете го апстрактот на Nature Research Report поврзан со оваа статија.
Податоците од MS протеомската анализа беа депонирани во конзорциумот ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) преку PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) со идентификаторот на множеството податоци PXD032157.
Збирот на податоци за RNA-seq е депониран во Сеопфатната библиотека за генска експресија (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под серискиот запис GSE198665.
Дополнителни збирки на податоци генерирани и/или анализирани за време на тековната студија може да се добијат од соодветните автори по разумно барање. Оваа статија ги дава изворните податоци.
Де Луф, А. Екдистероиди: Занемарени сексуални стероиди кај инсектите? Маж: Црна кутија. Наука за инсекти.13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-хидроксиекдизон и развој на јајниците кај Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).