Сортирањето на протеините во секреторниот пат е од суштинско значење за одржување на клеточната компартментализација и хомеостазата. Покрај сортирањето посредувано од обвивката, улогата на липидите во кинезинското сортирање во процесот на секреторен транспорт е долгогодишно основно прашање на кое сè уште не е одговорено. Овде, изведуваме 3D истовремено повеќебојно снимање во реално време со висока резолуција за да докажеме in vivo дека новосинтетизираните протеини имобилизирани со гликозилфосфатидилинозитол со многу долги липидни делови од керамид се групирани и класифицирани во специјализирани ендоплазми. Место на излез на мрежата, кое е различно од она што го користат трансмембранските протеини. Покрај тоа, покажуваме дека должината на ланецот на керамидот во мембраната на ендоплазматскиот ретикулум е клучна за оваа селективност на сортирање. Нашата студија обезбедува прв директен in vivo доказ за класификација на протеинските товари врз основа на должината на липидниот ланец во селективни места за извоз во секреторниот пат.
Во еукариотските клетки, протеините синтетизирани во ендоплазматскиот ретикулум (ER) потоа се сортираат за време на транспортот преку секреторниот пат за испорака до нивната соодветна клеточна дестинација (1). Покрај сортирањето посредувано од обвивката, долго време се шпекулираше дека одредени липиди можат да послужат и како селективни излезни точки со нивно групирање во специфични мембрански домени за специфични протеини (2-5). Сепак, сè уште недостасуваат директни in vivo докази за да се докаже овој можен механизам базиран на липиди. За да го решиме овој основен проблем, проучувавме кај квасецот како протеините закотвени на гликозилфосфатидилинозитол (GPI) (GPI-APs) се диференцијално експортираат од ER. GPI-APs се различни протеини на клеточната површина поврзани со липиди (6, 7). GPI-AP е секретиран протеин прикачен на надворешните ливчиња на плазматската мембрана преку гликолипидниот дел (GPI сидро). Тие ги прифаќаат GPI сидрата како конзервативни пост-транслациони модификации во луменот на ER (8). По прицврстувањето, GPI-AP поминува низ Голџиевиот апарат (5, 9) од ER до плазматската мембрана. Присуството на GPI сидра предизвикува GPI-AP да се транспортира одделно од трансмембранските секретирани протеини (вклучувајќи ги и другите протеини на плазматската мембрана) по секреторниот пат (5, 9, 10). Во клетките на квасецот, GPI-AP се одделени од другите секретирани протеини во ендоплазматскиот ретикулум, а потоа се спакувани во уникатни везикули обвиткани со комплекс II на протеини на обвивката (COPII) (6, 7). Детерминантите на овој процес на класификација во процесот на извоз на ER се нејасни, но се шпекулира дека овој механизам може да бара липиди, особено структурното ремоделирање на липидниот дел од GPI сидрото (5, 8). Кај квасецот, ремоделирањето на липидите на GPI започнува веднаш по прицврстувањето на GPI, а во многу случаи, предизвикува церамид да се врзе за заситената масна киселина со долг синџир од 26 јаглеродни атоми (C26:0) (11, 12). Церамидот C26 е главниот керамид произведен од квасните клетки досега. Се синтетизира во ER и поголемиот дел од него се извезува во Голџиевиот апарат преку везикулите COPII (13). Извозот на GPI-AP од ER конкретно бара континуирана синтеза на керамид (14, 15), а за возврат, конверзијата на керамид во инозитол фосфат керамид (IPC) во Голџиевиот апарат зависи од синтезата на GPI сидро (16). Биофизички студии со вештачки мембрани покажаа дека многу долгите ацилни синџири на керамид можат да се спојат за да формираат подредени домени со уникатни физички својства (17, 18). Овие податоци водат до хипотезата дека C26 керамидот и GPI-AP со C26 керамид ги користат своите физички својства за да се спојат во подредени региони или региони во релативно неуредна липидна средина на мембраната на ER. Тој е главно составен од кратки и незаситени глицеролипиди (C16:1 и C18:1) (19, 20). Овие региони ќе бидат селективно фокусирани на специфични места за излез од ER (ERES), каде што церамидот и GPI-AP-от базиран на церамид можат да бидат ко-транспортирани до Голџиевиот систем во истата наменска везикула COPII (5).
Во оваа студија, директно го тестиравме овој механизам базиран на липиди со користење на микроскопија со суперрезолуција со конфокална микроскопија во реално време (SCLIM), што е најсовремена техника на микроскопија која може истовремено да набљудува флуоресцентно обележани протеини. Трибојните и тридимензионалните (3D) слики имаат екстремно висока резолуција и брзина во живите клетки (21, 22).
Прво ја применивме SCLIM технологијата за дополнително да дефинираме како нормалниот GPI-AP со C26 керамид група беше скениран од трансмембрански секретирани протеини по напуштањето на ER во S. cerevisiae. За да ја провериме класификацијата на ER, користевме генетски систем кој може директно да го визуелизира новосинтетизираниот товар што влегува во ERES in vivo (7, 23). Како товар, го избравме GPI-AP Gas1 базиран на C26 керамид обележан со зелен флуоресцентен протеин (GFP) и трансмембрански секретиран протеин Mid2 обележан со флуоресцентен протеин во близина на инфрацрвениот спектар (iRFP), кои двата се насочени кон плазма мембраната (24-26). Кај мутантот sec31-1 чувствителен на температура, овие два товара се експресираат под промотор индуциран од галактоза и конститутивен ERES маркер. На екстремна температура (37°C), бидејќи мутацијата sec31-1 влијае на функцијата на компонентата на обвивката на COPII Sec31 за да го инхибира 'ртењето на COPII и извозот на ER, новосинтетизираниот товар се акумулира во ER (23). По ладењето на ниска температура (24°C), мутантите клетки sec31-1 се опоравија од секреторната област, а акумулираниот нов синтетички товар почна да се извезува од ER. CLIM визуелизацијата покажа дека поголемиот дел од новосинтетизираните Gas1-GFP и Mid2-iRFP сè уште се акумулираат во ER на мутантите клетки sec31-1 по инкубација на 37°C, а потоа се ослободуваат на 24°C во тек на 5 минути (Слика 1). Бидејќи Mid2-iRFP е дистрибуиран на целата мембрана на ER, а Gas1-GFP е концентриран и собран во дисконтинуираната мембранска област на ER, нивната дистрибуција е сосема различна (Слика 1, од А до C и Филм S1). Покрај тоа, како што е прикажано на Слика 1D, кластерот Gas1-GFP нема Mid2-iRFP. Овие резултати укажуваат дека GPI-AP и трансмембранските протеини биле рано одделени во различни региони на мембраната на ER. Кластерот Gas1-GFP е во непосредна близина на специфичен ERES обележан со протеинот на обвивката COPII на mCherry, Sec13 (Слика 1, E и F и филм S1) (23).
sec31-1 клетките експресираат секрети предизвикани од галактоза, долг ацилен синџир (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, зелена) и трансмембранскиот протеин Mid2-iRFP (TMP, сина) и ова конструктивно ERES обележување Sec13-mCherry (ERES, магента) беше инкубирано на 37°C 30 минути, поместено на 24°C и сликано со SCLIM 5 минути подоцна. (A до C) покажува репрезентативна споена или единечна 2D слика од рамнина (A), 2D проекциска слика од 10 z-пресеци (B) или 3D слика од хемисфера на клетките на товарот и ERES маркерите (C). Скала 1μm (A и B). Единицата на скала е 0,551μm (C). Gas1-GFP беше детектиран во дискретни ER региони или кластери, додека Mid2-iRFP беше детектиран и дистрибуиран низ целата ER мембрана (C). (D) Графиконот го прикажува релативниот интензитет на флуоресценција на Gas1-GFP и Mid2-iRFP во кластерот Gas1-GFP по должината на белата линија со стрелка (лево). AU, произволна единица. (E и F) претставуваат 3D слика што ги комбинира ознаките за добра и ERES. Кластерите Gas1-GFP беа откриени во близина на специфичниот ERES. Единицата на скалирање е 0,551μm. (F) Белата цврста стрелка го означува кластерот Gas1-GFP поврзан со ERES. Средните и десните панели ја прикажуваат споената зголемена 3D слика и ротиран поглед на избраниот кластер Gas1-GFP.
Блиската просторна врска помеѓу кластерот Gas1-GFP и специфичен ERES укажува дека Gas1-GFP може да влезе во селективен ERES, што е различно од селективноста што ја користи Mid2-iRFP за да го напушти ER. За да се справиме со оваа можност, го квантифициравме соодносот ERES само за една или две стоки (Слика 2, од А до C). Откривме дека повеќето ERES (70%) содржат само еден вид товар. Долната слика на Слика 2C покажува два типични примери на ERES само со Gas1-GFP (Слика 1) или само Mid2-iRFP (Слика 2). Спротивно на тоа, приближно 20% од ERES содржи два товара што се преклопуваат во истата област. Беше откриено дека некои ERES (10%) содржеле два вида товар, но тие биле изолирани во јасно различни области. Затоа, оваа статистичка анализа покажува дека откако ER ќе се извезе, GPI-AP Gas1-GFP и трансмембранскиот товар Mid2-iRFP се поделени на различни ERES (Слика 2D). Оваа ефикасност на сортирање е многу конзистентна со претходната биохемиска анализа (6) и морфолошко определување (7). Исто така, можеме да го набљудуваме однесувањето на карантинскиот товар што влегува во ERES (Слика 2E и Филм S2). Слика 2E покажува дека само мал дел од Gas1-GFP (панел 3) или Mid2-iRFP (панел 4) влегува во ERES од едната страна и е ограничен во дискретна област. Панел 5 од Слика 2E покажува дека Gas1-GFP и Mid2-iRFP понекогаш се наоѓаат во истиот ERES, но влегуваат од различни страни и се концентрирани во одделни региони што можат да претставуваат различни везикули COPII. Исто така, потврдивме дека набљудуваното одвојување и класификација на GPI-AP Gas1 базиран на C26 керамид како селективен ERES е специфично бидејќи друг трансмембрански секреторен товар, протеинот на плазма мембрана обележан со GFP Axl2 (27), покажува слично однесување како Mid2-iRFP. (Слика S1 и Филм S3). Новосинтетизираниот Axl2-GFP е дистрибуиран низ ER мембраната како Mid2-iRFP (Слика S1, A и B), и е ко-локализиран со Mid2-iRFP во повеќето ERES (Слика S1, B до D). Панелите 1 и 2 од Слика 1. S1C покажуваат два типични примери на ERES каде што две трансмембрански товари се преклопуваат. Во овие случаи, обете стоки влегуваат во ERES заедно (Слика S1E, Панел 3 и Филм S3).
Клетките sec31-1 кои експресираат секрети индуцибилни со галактоза, Gas1-GFP (GPI-AP, зелена) и Mid2-iRFP (TMP, сина) и конститутивно ERES обележување Sec13-mCherry (ERES, магента) беа поставени на 37°C. По инкубирање 30 минути на °C, преместете на 24°C за да го ослободите блокот за секреција и сликајте со SCLIM по 20 минути. (A до C) Репрезентативни 2D проекциски слики (A; лента на скалата, 1μm) или 3D слики од хемисфери на клетките (B и C; единица на скалата, 0,456μm) од товарот и 10 z-делови означени со ERES. Долниот панел во (B) и панелот во (C) прикажуваат обработени слики за да ги прикажат само стоките присутни во ERES (магента) [Gas1-GFP (сива) и Mid2-iRFP (светло сина)]. (C) Отворена стрелка: ERES носи само едно парче товар (1 до 4). Сива стрелка: ERES содржи одвоен товар (5). Бела непрекината стрелка: ERES содржи истовремен товар. Подолу: Избраниот единечен ERES содржи само Gas1-GFP (1) или Mid2-iRFP (2). Скала, 100 nm. (D) Квантификација на фотомикрографијата опишана во (C). Просечниот процент на ERES што содржи само едно товар (Gas1-GFP или Mid2-iRFP), одвоено товар и преклопувачко товар. Во три независни експерименти, n = 432 во 54 ќелии. Грешка = SD. Двостраен неспарен t-тест. *** P = 0,0002. (E) 3D слика од избран ERES од карантиниран товар означен со (C). Gas1-GFP (зелена) (3) или Mid2-iRFP (сина) (4) влегува во ERES (магента) од едната страна и е ограничен на мала површина во рамките на ERES. Понекогаш, двата вида товар влегуваат во истиот ERES (5) од истата страна и се ограничени на изолирана област во рамките на ERES. Ширина на скалата, 100 nm.
Потоа, тестиравме хипотеза дека долгиот ацилен синџир на церамид (C26) присутен во ER мембраната го поттикнува специфичното групирање и сортирање на Gas1 во селективен ERES. За таа цел, користевме модифициран сој на квасец GhLag1, во кој двете ендогени синтази на церамид Lag1 и Lac1 беа заменети со GhLag1 (хомологот Lag1 на памукот), што резултираше со сој на квасец со сој на церамид на клеточната мембрана пократок од дивиот тип (Слика 3А) (28). Анализата со масена спектрометрија (MS) покажа дека кај соевите од див тип, 95% од вкупниот церамид е многу долг (C26) синџир на церамид, додека кај GhLag1, 85% од церамидот е многу долг (C18 и C16). ), само 2% од церамидот е многу долг (C26) синџир на церамид. Иако C18 и C16 церамидите се главните церамиди откриени досега во мембраната GhLag1, MS анализата исто така потврди дека GPI сидрото на Gas1-GFP експресирано во сојот GhLag1 содржи C26 церамид, кој е споредлив со липидите од див тип. Квалитетот е ист (Сл. 3А) (26). Затоа, ова значи дека ензимот за ремоделирање на церамид Cwh43 е многу селективен за C26 церамид, како што е прикажано на Слика 26, тој преференцијално го вклучува GPI сидрото од мала количина на C26 церамид во сојот GhLag1. S2 (29). Сепак, клеточната мембрана на GhLag1 во основа содржи само C18-C16 церамид, додека Gas1-GFP сè уште има C26 церамид. Овој факт го прави овој сој идеална алатка за специфично решавање на проблемот со должината на ацилниот ланец на мембранскиот церамид во ER. Хипотетичката улога на класата и сортирањето. Потоа, прво ја проучивме способноста на C26 Gas1-GFP да се акумулира во кластери во GhLag1 со мутант алел sec31-1 чувствителен на температура преку конвенционална флуоресцентна микроскопија, каде што само долгиот (C18-C16) синџир постои во ER мембраната Керамид (Сл. 3). Забележавме дека во sec31-1, поголемиот дел од Gas1-GFP беше концентриран во кластери, додека Gas1-GFP во sec31-1 GhLag1 со долга (C18-C16) керамидна ER мембрана беше главно некласифицирана и дистрибуирана во целата ER мембрана. Поточно, бидејќи кластерирањето базирано на C26 керамид е тесно поврзано со специфичниот ERES (Слика 1), потоа истражувавме дали овој процес може да ја вклучува и функцијата на механизмот на експортниот протеин на ER. GPI-AP користи посебен COPII систем за експорт на ER, кој е активно регулиран со структурното ремоделирање на Ted1 на гликанскиот дел од GPI сидрото (30, 31). Рекомбинантниот GPI-гликан потоа се препознава од комплексот p24 на трансмембранскиот карго рецептор, кој пак селективно го регрутира Lst1, што е специфична изоформа на главната подгрупа Sec24 за врзување на карго на COPII, формирајќи везикули богати со GPI-AP. Потребни се везикули на COPII (31-33). Затоа, конструиравме двоен мутант кој ја комбинираше делецијата на овие единечни протеини (компонентата на p24 комплексот Emp24, ензимот за ремоделирање на GPI-гликан Ted1 и специфичниот COPII подгрупа Lst1) со мутантниот сој sec31-1 и ги проучивме дали е можно да се формира Gas1-кластер GFP (Слика 3). Забележавме дека кај sec31-1emp24Δ и sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP е главно некластериран и дистрибуиран низ целата ER мембрана, како што претходно беше видено кај sec31-1 GhLag1, додека кај sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP е како sec31-1. Овие резултати укажуваат дека покрај присуството на C26 керамид во ER мембраната, групирањето на Gas1-GFP треба да се врзе и за комплексот p24 и не бара специфично регрутирање на Lst1. Потоа, ја истраживме можноста дека должината на ланецот на керамидот во ER мембраната може да го регулира врзувањето на Gas1-GFP за p24. Сепак, откривме дека присуството на C18-C16 керамид во мембраната не влијае на GPI-гликаните реконструирани од комплексот p24 (Слики S3 и S4, A и B) или врзувањето за GPI-AP и извозот на GPI-AP. Регрутирање на COPII подтип Lst1 (Слика S4C). Затоа, групирањето зависно од C26 керамид не бара интеракции на протеини со различни механизми на извоз на протеини во ER, туку поддржува алтернативен механизам за сортирање управуван од должината на липидите. Потоа, анализиравме дали должината на ацилниот синџир на керамидот во ER мембраната е важна за ефективната класификација на Gas1-GFP како селективен ERES. Бидејќи Gas1 во сојот GhLag1 со церамид со краток синџир го напушта ER и влегува во плазма мембраната (Слика S5), веруваме дека ако сортирањето е водено од должината на церамидниот ацилен синџир, Gas1 во сојот GhLag1 може да се пренасочи и вкрсти. ERES стоки со иста мембрана.
(A) Клеточната мембрана на GhLag1 главно содржи пократки C18-C16 церамиди, додека GPI сидрото на Gas1-GFP сè уште има ист C26 IPC како клетките од див тип. Горе: анализа на должината на ацилниот ланец на церамидот во клеточната мембрана на соеви од див тип (Wt) и GhLag1p со масена спектрометрија (MS). Податоците го претставуваат процентот на вкупен церамид. Просекот од три независни експерименти. Грешка лента = SD. Двостраен неспарен t-тест. **** P <0,0001. Долен панел: MS анализа на должината на ацилниот ланец на IPC присутен во Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI сидрото изразено во соевите од див тип и GhLag1p. Податоците го претставуваат процентот на вкупниот IPC сигнал. Просек од пет независни експерименти. Грешка лента = SD. Двостраен неспарен t-тест. ns, не е важно. P = 0,9134. (B) Флуоресцентни микрографии на клетки sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ и sec31-1lst1Δ кои експресираат Gas1-GFP индуциран од галактоза беа инкубирани на 37°C 30 минути и предадени на рутинска флуоресцентна микроскопија по 24°C. Бела стрелка: ER Gas1-GFP кластер. Отворена стрелка: Некластерираниот Gas1-GFP е дистрибуиран на целата мембрана на ER, покажувајќи го карактеристичното боење на нуклеарниот прстен на ER. Скала, 5μm. (C) Квантификација на фотомикрографијата опишана во (B). Просечен процент на клетки со точкаста структура на Gas1-GFP. Во три независни експерименти, n≥300 клетки. Грешка = SD. Двостраен неспарен t тест. **** P <0,0001.
За директно решавање на овој проблем, извршивме SCLIM визуелизација на Gas1-GFP и Mid2-iRFP во GhLag1 со мутантниот алел sec31-1 чувствителен на температура (Слика 4 и филм S4). Откако ER беше задржан на 37°C и последователно ослободен на 24°C, поголемиот дел од новосинтетизираниот Gas1-GFP не беше групиран и дистрибуиран низ целата мембрана на ER, како што е забележано со конвенционални микроскопи (Слика 4, A и B). Покрај тоа, голем процент од ERES (67%) вклучува два вида товар ко-лоциран во него (Слика 4D). Панелите 1 и 2 од Слика 4C покажуваат два типични примери на ERES со преклопувачки Gas1-GFP и Mid2-GFP. Покрај тоа, обете добра беа регрутирани во истиот ERES (Слика 4E, панел 3 и филм S4). Затоа, нашите резултати покажуваат дека должината на церамид ацилниот ланец во мембраната на ER е важна детерминанта на агрегацијата и класификацијата на протеините на ER.
Sec31-1 GhLag1 клетки кои експресираат секрети предизвикани од галактоза, Gas1-GFP (GPI-AP, зелена) и Mid2-iRFP (TMP, сина) и конститутивна ERES-обележана Sec13-mCherry (ERES, магента). Инкубирајте на 37°C. Продолжете 30 минути, намалете ја температурата на 24°C за да се ослободат секретите и сликајте со SCLIM по 20 минути. (A до C) Репрезентативни 2D проекциски слики (A; лента на скалата, 1μm) или 3D слики од хемисфери на клетките (B и C; единица на скалата, 0,45μm) од 10-те z-делови означени со карго и ERES. Долниот панел во (B) и панелот во (C) прикажуваат обработени слики за да се прикажат само добрата присутни во ERES (магента) [Gas1-GFP (сива) и Mid2-iRFP (светло сина)]. (C) Стрелка исполнета со бело: ERES, добрата се преклопуваат. Отворена стрелка: ERES содржи само еден елемент. Долен панел: Избраниот ERES има преклопувачки добра (1 и 2) означени во (C). Скала, 100 nm. (D) Квантификација на фотомикрографијата опишана во (C). Во единиците sec31-1 и sec31-1 GhLag1, вклучен е само еден товар (Gas1-GFP или Mid2-iRFP), како и просечниот процент на ERES за изолиран товар и преклопувачки товар. Во три независни експерименти, n = 432 во 54 ќелии (sec31-1) и n = 430 во 47 ќелии (sec31-1 GhLag1). Грешка = SD. Двостраен неспарен t тест. *** P = 0,0002 (sec31-1) и ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D слика од избраниот ERES со преклопувачки товар (3) означен во (C). Gas1-GFP (зелена) и Mid2-iRFP (сина) се приближуваат кон ERES (магента) од истата страна и остануваат во истата ERES ограничена област. Ширина на скалата, 100 nm.
Оваа студија обезбедува директни in vivo докази дека протеинските товари базирани на липиди се класифицирани во селективни места за извоз во секреторниот пат и ја открива важноста на должината на ацилниот ланец за селективноста на класификацијата. Користејќи моќна и најсовремена техника на микроскопија наречена SCLIM, го демонстриравме новосинтетизираниот Gas1-GFP (главен GPI-AP на плазма мембраната со многу долг дел од ацилниот ланец (C26) на церамидниот липид) кај квасецот). Регионите групирани во дискретни ER се поврзани со специфични ERES, додека трансмембранските секретирани протеини се дистрибуирани низ целата ER мембрана (Слика 1). Покрај тоа, овие два вида стока селективно влегуваат во различни ERES (Слика 2). Должината на ацилниот ланец на клеточниот церамид во мембраната е намалена од C26 на C18-C16, кластерот Gas1-GFP е нарушен во дискретниот ER регион, а Gas1-GFP е пренасочен за да го напушти ER со трансмембранскиот протеин преку истиот ERES (Слика 3 и Слика 3). 4).
Иако GPI-AP користи специјализиран протеински механизам за излез од ERES, откривме дека одвојувањето зависно од C26 керамид не се потпира на диференцијални протеински интеракции што можат да доведат до специјализација на ERES (слики S4 и S5). Наместо тоа, нашите наоди поддржуваат алтернативен механизам за класификација управуван од групирање на протеини базирани на липиди и последователно исклучување на други товари. Нашите набљудувања покажуваат дека регионот или кластерот Gas1-GFP поврзан со специфичен ERES нема трансмембрански секретиран протеин Mid2-iRFP, што укажува дека кластерот GPI-AP зависен од керамид C26 ќе го олесни нивниот влез во релевантниот ERES, а во исто време, ќе ги исклучи трансмембранските секрети. Секретите влегуваат во овој конкретен ERES (слики 1 и 2). Спротивно на тоа, присуството на C18-C16 керамиди во мембраната на ER не предизвикува GPI-AP да формира региони или кластери, па затоа тие не ги исклучуваат или заменуваат трансмембранските секретирани протеини во истиот ERES (слики 3 и 4). Затоа, предлагаме дека церамидот C26 го поттикнува одвојувањето и класификацијата со олеснување на групирањето на протеините поврзани со специфични ERES.
Како да се постигне ова групирање зависно од C26 керамид во специфична област на ER? Тенденцијата на мембранскиот керамид да се одвои странично може да предизвика GPI-AP и C26 керамид да формираат мали и моментално подредени липиди во понеправилната липидна средина на мембраната на ER што содржи пократки и незаситени глицеролипиди. Квалитетни кластери (17, 18). Овие мали привремени кластери можат понатаму да се спојат во поголеми, постабилни кластери по врзувањето за комплексот p24 (34). Во согласност со ова, покажавме дека C26 Gas1-GFP треба да комуницира со комплексот p24 за да формира поголеми видливи кластери (Слика 3). Комплексот p24 е хетерозиготен олигомер составен од четири различни трансмембрански протеини p24 во квасецот (35), што обезбедува мултивалентно врзување, што може да доведе до вкрстено поврзување на мали кластери GPI-AP, со што се генерира поголем стабилен кластер (34). Интеракцијата помеѓу протеинските ектодомени на GPI-AP може исто така да придонесе за нивната агрегација, како што е прикажано за време на нивниот Голџиев транспорт во поларизирани епителни клетки кај цицачи (36). Меѓутоа, кога C18-C16 керамид е присутен во ER мембраната, кога комплексот p24 се врзува за Gas1-GFP, нема да се формираат големи одделни кластери. Основниот механизам може да зависи од специфичните физички и хемиски својства на долгиот ацилен синџир на керамид. Биофизички студии на вештачки мембрани покажуваат дека иако и долгите (C24) и кратките (C18-C16) ацилни синџирни керамиди можат да предизвикаат фазно раздвојување, само долгите ацилни синџирни керамиди (C24) можат да промовираат висока закривеност и свиткување на филмот за да го преобликуваат филмот. Преку меѓусебна референца (17, 37, 38). Покажано е дека трансмембранската спирала на TMED2, човечкиот хомолог на Emp24, селективно комуницира со сфингомиелин базиран на C18 керамид во цитоплазматските лобули (39). Користејќи симулации на молекуларна динамика (MD), откривме дека и C18 и C26 церамидите се акумулираат околу цитоплазматските лобули на трансмембранската спирала Emp24 и имаат слични преференции (Слика S6). Вреди да се напомене дека ова укажува дека трансмембранската спирала на Emp24 може да доведе до асиметрична дистрибуција на липиди во мембраната. Ова е неодамнешен резултат базиран на клетки од цицачи. Слични MD симулации, исто така, покажуваат присуство на етерски липиди (40). Затоа, шпекулираме дека C26 церамидот во двата лобули на ER26 е локално збогатен. Кога GPI-AP во луминалните лобули директно се врзува за мултивалентниот p24 и акумулацијата на C26 церамид околу p24 во цитоплазматските лобули, тоа може да ја поттикне придружната агрегација на протеини и закривување на мембраната што се генерира преку прстите (41), предизвикувајќи GPI-AP да се одвои во дискретни региони во непосредна близина на ERES, што исто така ги фаворизира многу закривените региони на ER мембраната (42). Претходните извештаи го поддржуваа предложениот механизам (43, 44). Мултивалентното врзување на олиголектини, патогени или антитела за гликосфинголипиди (GSL) базирани на керамид на плазматската мембрана предизвикува голема агрегација на GSL, го подобрува фазното раздвојување и предизвикува деформација и интернализација на мембраната (44). Ивабучи итн. (43) Утврдено е дека во присуство на долги (C24), но не и кратки (C16) ацилни ланци, мултивалентниот лиганд врзан за GSL лактозилцерамид предизвикува формирање на големи кластери и инвагинација на мембраната, а цитоплазмата со посредство на Лин трансдукција на сигналот на листовите е интердигитирана од ацилни ланци во споени неутрофили.
Кај поларизираните епителни клетки кај цицачите, концентрацијата на анти-Голџиевата мрежа (TGN) до нивото на апикалната плазма мембрана го контролира одвојувањето и сортирањето на GPI-AP (10, 45). Оваа агрегација е поттикната од олигомеризацијата на GPI-AP (36), но може да зависи и од должината на церамидниот синџир што го наоѓаме кај квасецот. Иако GPI-AP кај цицачите има сидро базирано на етерски липиди, а неговата хемиска структура е многу различна од многу долгиот ацилен синџир на церамид, неодамнешна студија покажа дека двата липиди имаат еволутивно слични физички и хемиски својства и функција (40). Затоа, етерскиот липиден дел во клетките на цицачите може да биде сличен на C26 церамидот кај квасецот, а неговата улога е да се поврзе со долгиот синџир на церамид во мембраната за да се промовира агрегацијата и сортирањето на GPI-AP. Иако оваа можност сè уште треба директно да се тестира, претходните наоди поддржуваат дека транспортот на долгиот ацилен синџир на церамид до Голџиевото тело не се врши од цитоплазматски трансферни протеини, туку зависи од синтезата на GPI сидра како квасецот. Затоа, се чини дека еволутивниот конзервативен механизам е способен селективно да ко-транспортира многу долг ацилен синџир на керамид и GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) во истата транспортна везикула.
Кај квасните и цицачките поларизирани епителни клеточни системи, агрегацијата и одвојувањето на GPI-AP од другите протеини на плазма мембраната се случуваат пред да стигнат до површината на клетката. Паладино и сор. (48) откриле дека на TGN на цицачките поларизирани епителни клетки, групирањето на GPI-AP не е потребно само за селективна класификација на GPI-AP на апикалната плазма мембрана, туку и ја регулира организацијата на групирање на GPI-AP и нивната биолошка активност. Клеточна површина. Кај квасците, оваа студија покажа дека кластерот GPI-AP зависен од керамид C26 на ER може да ја регулира организацијата на кластерот и функционалната активност на GPI-AP на плазма мембраната (24, 49). Во согласност со овој модел, клетките GhLag1 се алергични на GPI инхибитори или лекови кои влијаат на интегритетот на клеточниот ѕид (28), а потребата за функционални кластери Gas1-GFP (49) на врвниот керамид проектирани при парењето на клетките од квасец укажува на G​​​ Можни физиолошки последици од hLag1 клетките. Грешка во GPI-AP. Сепак, понатамошното тестирање дали функционалната организација на клеточната површина е програмирана од ER со метод на сортирање базиран на должината на липидите ќе биде предмет на нашите идни истражувања.
Соевите Saccharomyces cerevisiae што се користат во оваа работа се наведени во Табела S1. Соевите MMY1583 и MMY1635 на SCLIM за снимање на живи клетки беа конструирани во позадина на W303. Овие соеви што експресираат Sec13-mCherry со флуоресцентна протеинска ознака беа конструирани со користење на метод базиран на полимеразна верижна реакција (PCR) со плазмид pFA6a како шаблон (23). Сојот што експресира Mid2-iRFP обележан со флуоресцентен протеин под контрола на промотерот GAL1 беше конструиран на следниов начин. PCR амплификација на iRFP-KanMx секвенцата од вектор pKTiRFP-KAN (подарок од E. O'Shea, број на плазмид Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; идентификатор на истражувачки ресурс (RRID): Addgene_64687) И вметнати во C-терминалот на ендогениот Mid2. Откако секвенцата на геномот Mid2-iRFP беше амплифицирана и клонирана во промотерот GAL1, таа беше интегрирана во местото Not I-Sac I на интеграцискиот плазмид pRS306. Добиениот плазмид pRGS7 беше линеаризиран со Pst I за да се интегрира во локусот URA3.
Фузискиот ген Gas1-GFP се експресира под контрола на промотерот GAL1 во плазмидот на центромер (CEN), кој е конструиран на следниов начин. Секвенцата Gas1-GFP беше амплифицирана со PCR од плазмидот pRS416-GAS1-GFP (24) (дар од L. Popolo) и клонирана во местото Xma I–Xho I на плазмидот CEN pBEVY-GL LEU2 (дар од C). Miller; Addgene плазмид број 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Резултирачкиот плазмид беше именуван pRGS6. Фузискиот ген Axl2-GFP се експресира исто така под контрола на промотерот GAL1 на векторот pBEVY-GL LEU2, а неговата конструкција е на следниов начин. Axl2-GFP секвенцата беше амплифицирана од плазмидот pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) со PCR и клонирана во местото Bam HI-Pst I на векторот pBEVY-GL LEU2. Добиениот плазмид беше именуван pRGS12. Секвенцата на олигонуклеотидите што се користеа во оваа студија е наведена во Табела S2.
Сојот беше дополнет со 0,2% аденин и 2% гликоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-рафиноза] богата со протеинска p (YP) медиум за екстракт од квасец (1% екстракт од квасец и 2% протеински ept). (YPR)] или 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] како извор на јаглерод, или во синтетичка минимална медиум (0,15% азотна база на квасец и 0,5% амониум сулфат) за да се дополнат соодветните аминокиселини и бази потребни за исхрана, и содржи 2% гликоза (синтетичка минимална гликоза медиум) или 2% галактоза (синтетичка галактоза минимална медиум) како извор на јаглерод.
За снимање во реално време, температурно чувствителни мутантни клетки sec31-1 кои го експресираат конструктот под промотерот GAL1 беа одгледувани во YPR медиум на 24°C преку ноќ до средна логаритамска фаза. По индукција во YPG на 24°C во тек на 1 час, клетките беа инкубирани во SG на 37°C во тек на 30 минути, а потоа префрлени на 24°C за да се ослободат од блокот за секреција. Конканавалин А беше употребен за фиксирање на клетките на стаклено стакло и беа сликани со SCLIM. SCLIM е комбинација од инвертиран флуоресцентен микроскоп Olympus IX-71 и леќа со масло со нумерички отвор UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), конфокален скенер со ротирачки диск со голема брзина и висок сооднос сигнал-шум (Yokogawa Electric), спектрометр по нарачка и ладење по нарачка. Засилувачот на слика на системот (Hamamatsu Photonics) може да обезбеди систем на леќи за зголемување со конечно зголемување од ×266.7 и камера со уред поврзан со полнеж што ги множи електроните (Hamamatsu Photonics) (21). Снимањето на сликата се врши со софтвер по нарачка (Yokogawa Electric). За 3D слики, користевме пиезоелектричен актуатор по нарачка за вертикално вибрирање на објективот и ги собравме оптичките делови на растојание од 100 nm еден од друг во стек. Z-стекот на сликата се претвора во 3D вокселни податоци, а теоретската функција за ширење на точки што се користи за конфокалниот микроскоп со ротирачки диск се користи за обработка на деконволуција од софтверот Volocity (PerkinElmer). Со користење на софтверот Volocity за автоматско одредување на прагот за анализа на колокација, беше измерен ERES, вклучувајќи го и товарот. Анализата на линиско скенирање беше извршена со користење на софтверот MetaMorph (Molecular Devices).
Користете го софтверот GraphPad Prism за да ја одредите статистичката значајност. За двостраниот Студентов t-тест и тестот за обична еднонасочна анализа на варијансата (ANOVA), се смета дека разликите меѓу групите имаат значајно влијание врз P <0,05 (*).
За флуоресцентна микроскопија на Gas1-GFP, клетките во логаритамска фаза беа одгледувани преку ноќ во YPD и собрани со центрифугирање, измиени двапати со фосфатен пуфериран солен раствор и инкубирани на мраз најмалку 15 минути, а потоа се продолжи под микроскоп како што е претходно опишано во Проверка (24). За аквизиција беше користен микроскопот Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) опремен со објектив, L5 (GFP) филтер, камера Hamamatsu и софтвер Application Suite X (LAS X).
Примероците беа денатурирани со SDS пуфер за примероци на 65°C во тек на 10 минути, а потоа одделени со електрофореза на SDS-полиакриламиден гел (PAGE). За анализа на имуноблотинг, по лента беа внесени 10 μl примерок. Примарно антитело: Користете поликлонално анти-Gas1 зајак во разредување од 1:3000, поликлонално анти-Emp24 зајак во разредување од 1:500 и поликлонално анти-GFP зајак (подарок од Х. Ризман) во разредување од 1:3000. Глувчешкото моноклонално анти-Pgk1 антитело беше користено во разредување од 1:5000 (подарок од Ј. де ла Круз). Секундарно антитело: Конјугиран козји анти-зајачки имуноглобулин G (IgG) со рен пероксидаза (HRP) во разредување од 1:3000 (Пирс). HRP-конјугиран козји анти-глувчешки IgG беше користен во разредување од 1:3000 (Пирс). Зоната на имунолошкиот одговор беше набљудувана со методот на хемилуминисценција на реагенсот SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Како што е опишано во (31), експеримент со природна имунопреципитација беше извршен на збогатената ER фракција. Накратко, измијте ги квасните клетки со TNE пуфер [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM фенилметилсулфонил флуорид и мешавина од инхибитори на протеаза) на 600 nm (OD600) при оптичка густина од 100 двапати. Тој беше скршен со стаклени зрна, а потоа клеточните остатоци и стаклените зрна беа отстранети со центрифугирање. Супернатантот потоа беше центрифугиран на 17.000 g во тек на 15 минути на 4°C. Пелетот беше ресуспендиран во TNE и беше додаден дигиталис сапонин до конечна концентрација од 1%. Суспензијата беше инкубирана 1 час со ротација на 4°C, а потоа нерастворливите компоненти беа отстранети со центрифугирање на 13.000 g на 4°C во тек на 60 минути. За имунопреципитација на Gas1-GFP, прво претходно инкубирајте го примерокот со празни агарозни зрна (ChromoTek) на 4°C во тек на 1 час, а потоа инкубирајте со GFP-Trap_A (ChromoTek) на 4°C во тек на 3 часа. Имунопреципитираните зрна беа измиени пет пати со TNE што содржи 0,2% дигоксигенин, елуирани со SDS пуфер за примероци, одделени на SDS-PAGE и анализирани со имуноблотинг.
Како што е опишано во (31), одредувањето на вкрстеното поврзување беше извршено на збогатената ER фракција. Накратко, збогатената ER фракција беше инкубирана со 0,5 mM дитиобис(сукцинимидил пропионат) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 мин). Реакцијата на вкрстено поврзување беше запрена со додавање на глицин (50 mM конечна концентрација, 5 минути, 20°C).
Како што беше претходно опишано (50), беше извршена MS анализа на керамид во соеви од див тип и GhLag1. Накратко, клетките беа одгледувани до експоненцијална фаза (3 до 4 OD600 единици/ml) во YPD на 30°C, а беа собрани 25×107 клетки. Нивниот метаболизам е забавен со трихлороцетна киселина. Користете растворувач за екстракција [етанол, вода, етер, пиридин и 4,2 N амониум хидроксид (15:15:5:1:0,018 v/v)] и 1,2 nmol внатрешен стандарден квалитет на керамид C17 (860517, Avanti поларен липид)). Користете монометиламин реагенс [метанол, вода, n-бутанол и раствор на метиламин (4:3:1:5 v/v)] за да извршите блага алкална хидролиза на екстрактот, а потоа користете n-бутанол заситен со вода за десалација. Конечно, екстрактот беше ресуспендиран во растворувач во позитивен режим [хлороформ/метанол/вода (2:7:1) + 5 mM амониум ацетат] и инјектиран во масениот спектрометар. За идентификација и квантификација на молекулите на сфинголипидите беше извршено следење на повеќе реакции (MRM). Терцијарниот квадрополен масен спектрометар TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) е опремен со роботски извор на јони на нанопроток Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) за анализа на липиди. Енергијата на судир е оптимизирана за секоја категорија на керамид. MS податоците се добиени во позитивен режим. За секоја биолошка репликација, липидниот сигнал е средна вредност од три независни мерења.
Како што е опишано во (31), клетките (800×107) што го експресираат Gas1-GFP беа подложени на природна имунопреципитација. Прочистениот Gas1-GFP беше одвоен со SDS-PAGE и префрлен на мембрана од поливинилиден флуорид (PVDF). Протеинот беше визуелизиран со боење на PVDF со амид црно. Gas1-GFP лентата беше исечена од PVDF и измиена 5 пати со метанол и еднаш со вода од течна хроматографија-MS (LC-MS). Со инкубирање на мембранската лента со 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), пуфер и 500 μl свежо растворена мешавина од 1 M натриум нитрит на 37°C во тек на 3 часа, липидната фракција се ослободува од Gas1-GFP и се лизира. Ослободување на инозин фосфат керамид помеѓу глукозамин и инозитол (51). После тоа, мембранската лента беше измиена четири пати со вода од LC-MS степен, исушена на собна температура и складирана во азотна атмосфера на -80°C до анализата. Како контрола, за секој експеримент беше користен празен примерок од PVDF мембрана. Липидот екстрахиран од Gas1-GFP потоа беше анализиран со MS како што е опишано (50). Накратко, PVDF лентите што содржат GPI-липид беа ресуспендирани во 75 μl негативен растворувач за мувла [хлороформ/метанол (1:2) + 5 mM амониум ацетат] и поминаа електроспреј јонизација (ESI)-MRM/MS анализа на сфинголипидни видови (TSQ Vantage). Во овој случај, MS податоците беа добиени во режим на негативни јони.
Како што споменавме претходно, липидниот дел од GPI сидрото беше одвоен од GPI-AP обележан со [3H]-инозитол (16). Липидите беа одвоени со тенкослојна хроматографија користејќи систем на растворувачи (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) и визуелизирани користејќи FLA-7000 (Fujifilm).
Клетките што експресираат Gas1-GFP (600×107) беа измиени двапати со TNE пуфер со TNE пуфер, скршени со стаклени зрна, а потоа центрифугирани за да се отстранат клеточните остатоци и стаклените зрна. Супернатантот потоа беше центрифугиран на 17.000 g во тек на 1 час на 4°C. Пелетот беше измиен во TNE и инкубиран со 1 U PI-PLC (Invitrogen) во TNE што содржи 0,2% дигиталис сапонин во тек на 1 час на 37°C. По третманот со ензими, мембраната беше отстранета со центрифугирање на 17.000 g на 4°C во тек на 1 час. За имунопреципитација на Gas1-GFP, супернатантот беше инкубиран со GFP-Trap_A (ChromoTek) на 4°C преку ноќ. Прочистениот Gas1-GFP одвоен со SDS-PAGE беше обоен со Coomassie брилијантно сино. Бојната лента Gas1-GFP беше отсечена од сивата боја што го опкружува аквадуктот, а потоа по алкилација со јодоацетамид и редукција со дитиотреитол, беше извршено варење во гел со трипсин. Екстрактирајте и исушете ги триптичките пептиди и пептидите со GPI-гликани. Исушениот пептид беше растворен во 20 μl вода. Инјектирајте дел (8 μl) во LC. За одвојување на пептидите под специфични градиентни услови беше употребена колона од октадецилсилан (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; внатрешен дијаметар 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Аичи Префектура, Јапонија). Мобилната фаза е растворувач А (0,08% мравја киселина) и растворувач Б (0,15% мравја киселина во 80% ацетонитрил). За елуирање на колоната со растворувач А во рок од 55 минути со брзина на проток од 50 μl min-1 во тек на 5 минути, беше користен Accela HPLC систем (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Масачусетс), а потоа концентрацијата на растворувачот Б беше зголемена на 40%. (Соединети Американски Држави). Елуатот континуирано се внесуваше во изворот на ESI јони, а триптичките пептиди и пептидите со GPI-гликани беа анализирани со LTQ Orbitrap XL (хибриден линеарен јонски стапица-орбитрап масен спектрометр; Thermo Fisher Scientific). Во MS подесувањето, напонот на капиларниот извор беше поставен на 4,5 kV, а температурата на преносниот капилар беше одржувана на 300°C. Капиларниот напон и напонот на леќата на цевката беа поставени на 15 V и 50 V, соодветно. MS податоците се добиени во режим на позитивни јони (резолуција од 60.000; точност на масата од 10 делови на милион) во опсег на маса од 300/m/z сооднос маса/полнеж (m/z) 3000. MS/MS податоците се добиваат преку јонската стапица во LTQ Orbitrap XL [првите 3 цифри од кои зависат податоците, дисоцијација предизвикана од судир (CID)].
MD симулациите беа извршени со користење на софтверот GROMACS (52) и силовото поле MARTINI 2 (53-55). Потоа, CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) беше користен за конструирање на двослој што содржи диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) и Cer C18 или DOPC и Cer C26. Топологијата и координатите на Cer C26 се добиени од DXCE со отстранување на дополнителните зрна од опашката на сфингозинот. Користете го процесот опишан подолу за да го балансирате двојниот слој и да го стартувате, а потоа користете ги последните координати на системот за да изградите систем што содржи Emp24. Трансмембранскиот домен на квасецот Emp24 (остатоци 173 до 193) беше конструиран како α-хеликс со користење на визуелната алатка MD (VMD) за молекуларна структура (58). Потоа, по отстранувањето на преклопувачките липиди, протеинот беше грубо гранулиран и вметнат во двослојот со користење на CHARMM GUI. Конечниот систем содржи 1202 DOPC и 302 Cer C26 или 1197 DOPC и 295 Cer C18 и Emp24. Јонизирајте го системот до концентрација од 0,150M. Направени се четири независни реплики за два двослојни состави.
Липидниот двослој се балансира со помош на процесот CHARMM GUI, кој вклучува минимизирање, а потоа балансирање на 405.000 чекори, каде што ограничувањата на позицијата постепено се намалуваат и елиминираат, а временскиот чекор се зголемува од 0,005 ps на 0,02 ps. По изедначувањето, се произведуваат 6 µs со временски чекор од 0,02 ps. По вметнувањето на Emp24, се користи истиот процес CHARMM GUI за минимизирање и балансирање на системот, а потоа се извршува 8 секунди во производство.
За сите системи, за време на процесот на балансирање, притисокот се контролира со баростат Берендсен (59), а за време на процесот на производство, притисокот се контролира со баростат Паринело-Рахман (60). Во сите случаи, просечниот притисок е 1 бар и се користи полуизотропна шема за спојување на притисокот. Во процесот на балансирање и производство, термостат (61) со рекалибрација на брзината се користи за спојување на температурата на протеините, липидите и честичките од растворувачот, соодветно. Во текот на целата операција, целната температура е 310K. Неврзувачката интеракција се пресметува со генерирање листа за спарување користејќи ја Верлетовата шема со толеранција на пуфер од 0,005. Кулоновиот член се пресметува со користење на реакционото поле и гранично растојание од 1,1 nm. Вандер-Валсовиот член користи гранична шема со гранично растојание од 1,1 nm, а Верлетовата гранична шема се користи за потенцијално поместување (62).
Користејќи VMD, граничната бранова должина помеѓу DOPC фосфатните зрна или керамидните AM1 зрна и протеинот е 0,7 nm, а бројот на липиди што реагираат со протеинот се пресметува. Според следната формула, пресметајте го факторот на осиромашување-збогатување (DE) како во (63): DE фактор = (количината на вкупни липиди во протеинот 0,7) во протеинот 0,7 (количината на Cer во вкупните липиди)
Пријавената вредност се добива како просек, а лентите за грешка се четири независни копии на SE. Статистичката значајност на DE факторот се пресметува со t-тест [(просечен DE-фактор-1)/SE]. Пресметајте ја P вредноста од едностраната распределба.
Алатката GROMACS беше употребена за пресметување на 2D мапата на латерална густина на системот што содржи Emp24 во последните 250 ns од трагата. За да се добие мапата на збогатување/осиромашување на керамид, мапата на густина на Cer се дели со збирот од мапата на Cer и DOPC, а потоа се дели со концентрацијата на Cer во телото. Се користи истата скала на мапа на бои.
За дополнителни материјали за овој напис, видете http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ова е статија со отворен пристап дистрибуирана според условите на лиценцата „Криејтив комонс“ - Наведи извор - Некомерцијално, која дозволува употреба, дистрибуција и репродукција во кој било медиум, сè додека конечната употреба не е за комерцијална добивка и премисата е дека оригиналното дело е точно. Референца.
Забелешка: Ве молиме само да ја наведете вашата е-адреса за лицето што го препорачувате на страницата да знае дека сакате да ја види е-поштата и дека не е спам. Нема да ги снимиме е-адресите.
Ова прашање се користи за да се провери дали сте посетител и да се спречи автоматско поднесување на спам.
Софија Родригез-Галардо, Казуо Курокава, Сузана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортез · Гомез (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерија Зони (Валерија Зони), Аксилиадора Агилера-Ромеро-Лопез Лопез Лопез, Ана Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мијако Риман (Мијако Риман), Проу Акира, Стефано Фани, Акихико Накано, Мануел Муниз
3D снимањето во реално време со висока резолуција ја открива важноста на должината на церамидниот синџир за сортирање на протеините на селективни излезни места.
Софија Родригез-Галардо, Казуо Курокава, Сузана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортез · Гомез (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерија Зони (Валерија Зони), Аксилиадора Агилера-Ромеро-Лопез Лопез Лопез, Ана Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мијако Риман (Мијако Риман), Проу Акира, Стефано Фани, Акихико Накано, Мануел Муниз
3D снимањето во реално време со висока резолуција ја открива важноста на должината на церамидниот синџир за сортирање на протеините на селективни излезни места.
©2020 Американско здружение за унапредување на науката. сите права се задржани. AAAS е партнер на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.