Претходно објавивме дека серумските нивоа на триптофанскиот метаболит добиен од цревата, индол-3-пропионска киселина (IPA), се пониски кај пациенти со фиброза на црниот дроб. Во оваа студија, ги испитавме транскриптомите и ДНК метиломите кај гојазни црни дробови во однос на серумските нивоа на IPA, како и улогата на IPA во индуцирањето на фенотипска инактивација на хепаталните стелатни клетки (HSCs) in vitro.
Студијата вклучуваше 116 пациенти со дебелина без дијабетес мелитус тип 2 (Т2ДМ) (возраст 46,8 ± 9,3 години; БМИ: 42,7 ± 5,0 кг/м²) кои беа подложени на баријатриска хирургија во Центарот за баријатриска хирургија Куопио (KOBS). Нивоата на IPA во циркулацијата беа мерени со течна хроматографија-масена спектрометрија (LC-MS), анализата на транскриптомот на црниот дроб беше извршена со секвенционирање на тотална РНК, а анализата на метилацијата на ДНК беше извршена со користење на Infinium HumanMethylation450 BeadChip. За in vitro експерименти беа користени човечки хепатални стелатни клетки (LX-2).
Серумските нивоа на IPA беа во корелација со експресијата на гените вклучени во апоптотичките, митофагичните и патеките на долговечност во црниот дроб. Генот AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) беше најзастапениот и доминантен интерактивен ген во профилите на транскрипт на црниот дроб и метилација на ДНК. Третманот со IPA предизвика апоптоза, намалено митохондријално дишење и изменета клеточна морфологија и митохондријална динамика со модулирање на експресијата на гени за кои е познато дека ја регулираат фиброзата, апоптозата и преживувањето на LX-2 клетките.
Земени заедно, овие податоци потврдуваат дека IPA има потенцијални терапевтски ефекти и може да предизвика апоптоза и да го помести фенотипот на HSC кон неактивна состојба, со што се проширува можноста за инхибирање на фиброзата на црниот дроб преку мешање во активацијата на HSC и митохондријалниот метаболизам.
Преваленцата на дебелина и метаболички синдром е поврзана со зголемена инциденца на метаболички поврзана масна болест на црниот дроб (MASLD); болеста зафаќа 25% до 30% од општата популација [1]. Главната последица од етиологијата на MASLD е фиброзата на црниот дроб, динамичен процес кој се карактеризира со континуирана акумулација на фиброзен екстрацелуларен матрикс (ECM) [2]. Главните клетки вклучени во фиброзата на црниот дроб се хепаталните стелатни клетки (HSCs), кои покажуваат четири познати фенотипови: мирни, активирани, инактивирани и стареечки [3, 4]. HSCs можат да се активираат и трансдиференцираат од мирна форма во пролиферативни клетки слични на фибробласти со високи енергетски потреби, со зголемена експресија на α-актин на мазните мускули (α-SMA) и колаген тип I (Col-I) [5, 6]. За време на пресвртот на фиброзата на црниот дроб, активираните HSCs се елиминираат преку апоптоза или инактивација. Овие процеси вклучуваат намалување на фиброгените гени и модулација на про-преживувачките гени (како што се NF-κB и PI3K/Akt сигналните патишта) [7, 8], како и промени во митохондријалната динамика и функција [9].
Серумските нивоа на триптофанскиот метаболит индол-3-пропионска киселина (IPA), произведени во цревата, се намалени кај човечки метаболички заболувања, вклучувајќи го и MASLD [10–13]. IPA е поврзан со внесот на диететски влакна, познат е по своите антиоксидантни и антиинфламаторни ефекти и го намалува фенотипот на неалкохолен стеатохепатитис (NASH) предизвикан од исхраната in vivo и in vitro [11–14]. Некои докази доаѓаат од нашата претходна студија, која покажа дека серумските нивоа на IPA се пониски кај пациенти со фиброза на црниот дроб отколку кај пациенти со дебелина без фиброза на црниот дроб во Студијата за баријатриска хирургија Куопио (KOBS). Понатаму, покажавме дека третманот со IPA може да ја намали експресијата на гени кои се класични маркери на адхезија на клетките, миграција на клетките и активирање на хематопоетски матични клетки во модел на човечки хепатални стелатни клетки (LX-2) и е потенцијален хепатопротективен метаболит [15]. Сепак, останува нејасно како IPA предизвикува регресија на фиброзата на црниот дроб со активирање на апоптозата на HSC и митохондријалната биоенергетика.
Тука, покажуваме дека серумската IPA е поврзана со експресијата на гени збогатени со апоптоза, митофагија и патеки на долговечност во црниот дроб кај лица со дебелина, но без дијабетес тип 2 (KOBS). Понатаму, откривме дека IPA може да предизвика чистење и деградација на активирани хематопоетски матични клетки (HSCs) преку патеката на инактивација. Овие резултати откриваат нова улога за IPA, што ја прави потенцијална терапевтска цел за промовирање на регресија на фиброзата на црниот дроб.
Претходна студија во кохортата KOBS покажа дека пациентите со фиброза на црниот дроб имале пониски нивоа на IPA во циркулацијата во споредба со пациентите без фиброза на црниот дроб [15]. За да се исклучи потенцијалниот збунувачки ефект на дијабетес тип 2, регрутиравме 116 пациенти со дебелина без дијабетес тип 2 (просечна возраст ± SD: 46,8 ± 9,3 години; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Табела 1) од тековната KOBS студија како популација на студии [16]. Сите учесници дадоа писмена информирана согласност, а протоколот на студијата беше одобрен од Етичкиот комитет на болницата во округот Норт Саво во согласност со Декларацијата од Хелсинки (54/2005, 104/2008 и 27/2010).
Примероците од биопсија на црниот дроб беа добиени за време на баријатриска хирургија и хистолошки оценети од искусни патолози според претходно опишаните критериуми [17, 18]. Критериумите за проценка се сумирани во Дополнителната табела S1 и се опишани претходно [19].
Примероците од серум на гладно беа анализирани со нецелна течна хроматографија-масена спектрометрија (LC-MS) за метаболомичка анализа (n = 116). Примероците беа анализирани со користење на UHPLC-qTOF-MS систем (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) како што е претходно опишано19. Идентификацијата на изопропил алкохол (IPA) беше базирана на времето на задржување и споредбата на MS/MS спектарот со чисти стандарди. Интензитетот на IPA сигналот (површината на пикот) беше земен предвид во сите понатамошни анализи [20].
Секвенционирањето на РНК на целиот црн дроб беше извршено со употреба на Illumina HiSeq 2500, а податоците беа претходно обработени како што е опишано претходно [19, 21, 22]. Извршивме целна диференцијална анализа на експресија на транскрипти што влијаат на митохондријалната функција/биогенеза користејќи 1957 гени избрани од базата на податоци MitoMiner 4.0 [23]. Анализата на метилација на ДНК на црниот дроб беше извршена со употреба на Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан Диего, Калифорнија, САД) користејќи ја истата методологија како што е опишано претходно [24, 25].
Човечките хепатални стелатни клетки (LX-2) беа љубезно обезбедени од проф. Стефано Ромео и беа култивирани и одржувани во DMEM/F12 медиум (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). За да се избере работната доза на IPA, LX-2 клетките беа третирани со различни концентрации на IPA (10 μM, 100 μM и 1 mM; Sigma, 220027) во DMEM/F12 медиум во тек на 24 часа. Понатаму, за да се испита способноста на IPA да ги инактивира HSC, LX-2 клетките беа ко-третирани со 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) и 1 mM IPA во медиум без серум во тек на 24 часа. За соодветните контроли со носач, за третман со TGF-β1 беше употребен 4 nM HCL што содржи 0,1% BSA, а за третман со IPA беше употребен 0,05% DMSO, а двата беа употребени заедно за комбинираниот третман.
Апоптозата беше оценета со помош на комплетот за детекција на апоптоза FITC Annexin V со 7-AAD (Biolegend, Сан Диего, Калифорнија, САД, кат бр. 640922) според упатствата на производителот. Накратко, LX-2 (1 × 105 клетки/бунар) беа култивирани преку ноќ во плочи со 12 бунари, а потоа третирани со повеќекратни дози на IPA или IPA и TGF-β1. Следниот ден, лебдечките и адхерентните клетки беа собрани, трипсинизирани, измиени со PBS, ресуспендирани во врзувачки пуфер за Annexin V и инкубирани со FITC-Annexin V и 7-AAD 15 минути.
Митохондриите во живите клетки беа обоени за оксидативна активност со користење на Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). За MTR тестови, LX-2 клетките беа инкубирани со еднакви густини со IPA и TGF-β1. По 24 часа, живите клетки беа трипсинизирани, измиени со PBS, а потоа инкубирани со 100 μM MTR во медиум без серум на 37 °C во тек на 20 минути како што е претходно опишано [26]. За анализа на морфологијата на живите клетки, големината на клетките и цитоплазматската комплексност беа анализирани со користење на параметри на напредно расејување (FSC) и странично расејување (SSC), соодветно.
Сите податоци (30.000 настани) беа добиени со помош на NovoCyte Quanteon (Agilent) и анализирани со помош на софтверот NovoExpress® 1.4.1 или FlowJo V.10.
Стапката на потрошувачка на кислород (OCR) и стапката на екстрацелуларна ацидификација (ECAR) беа мерени во реално време со помош на анализатор на екстрацелуларен флукс Seahorse (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорнија) опремен со Seahorse XF Cell Mito Stress според упатствата на производителот. Накратко, 2 × 104 LX-2 клетки/бунар беа засеани на плочи за клеточни култури XF96. По инкубација преку ноќ, клетките беа третирани со изопропанол (IPA) и TGF-β1 (Дополнителни методи 1). Анализата на податоците беше извршена со помош на софтверот Seahorse XF Wave, кој го вклучува генераторот на извештај за тест на фенотип на енергија на клетките Seahorse XF. Од ова, беше пресметан индексот на биоенергетско здравје (BHI) [27].
Вкупната РНК беше транскрибирана во кДНК. За специфични методи, видете ја референцата [15]. Нивоата на мРНК на човечкиот 60S рибозомален кисел протеин P0 (RPLP0) и циклофилин А1 (PPIA) беа користени како конститутивни генски контроли. Системот QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Холандија) беше користен со комплетот TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) или комплетот Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), а релативното преклопување на генската експресија беше пресметано со користење на компаративни параметри на циклус на вредноста Ct (ΔΔCt) и методот ΔΔCt. Детали за прајмерите се дадени во дополнителните табели S2 и S3.
Нуклеарната ДНК (ncDNA) и митохондријалната ДНК (mtDNA) беа екстрахирани со користење на комплетот за крв и ткиво DNeasy (Qiagen) како што беше претходно опишано [28]. Релативната количина на mtDNA беше пресметана со пресметување на односот на секој целен mtDNA регион со геометриската средна вредност на трите нуклеарни ДНК региони (mtDNA/ncDNA), како што е детално опишано во Дополнителните методи 2. Детали за прајмерите за mtDNA и ncDNA се дадени во Дополнителната табела S4.
Живите клетки беа обоени со Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) за да се визуелизираат меѓуклеточните и интрацелуларните митохондријални мрежи. LX-2 клетките (1 × 104 клетки/бунар) беа култивирани на стаклени плочки во соодветни културни плочи со стаклено дно (Ibidi GmbH, Martinsried, Германија). По 24 часа, живите LX-2 клетки беа инкубирани со 100 μM MTR 20 минути на 37 °C, а клеточните јадра беа обоени со DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) како што е претходно опишано [29]. Митохондријалните мрежи беа визуелизирани со помош на инвертиран микроскоп Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Јена, Германија) опремен со конфокален модул Zeiss LSM 800 на 37 °C во влажна атмосфера со 5% CO2 со помош на објектив 63×NA 1.3. Добивме десет слики од Z-серијата за секој тип на примерок. Секоја Z-серија содржи 30 делови, секој со дебелина од 9,86 μm. За секој примерок, слики од десет различни видни полиња беа добиени со помош на софтверот ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Јена, Германија), а анализата на митохондријалната морфологија беше извршена со помош на софтверот ImageJ (v1.54d) [30, 31] според параметрите детално наведени во Дополнителните методи 3.
Клетките беа фиксирани со 2% глутаралдехид во 0,1 M фосфатен пуфер, по што следеше фиксација со 1% раствор на осмиум тетроксид (Sigma Aldrich, MO, САД), постепено дехидрирани со ацетон (Merck, Darmstadt, Германија) и конечно вградени во епоксидна смола. Ултратенки пресеци беа подготвени и обоени со 1% уранил ацетат (Merck, Darmstadt, Германија) и 1% оловен цитрат (Merck, Darmstadt, Германија). Ултраструктурните слики беа добиени со помош на трансмисионен електронски микроскоп JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Токио, Јапонија) при забрзувачки напон од 80 kV.
Морфологијата на LX-2 клетките третирани со IPA во тек на 24 часа беше анализирана со фазно-контрастна микроскопија при 50x зголемување со употреба на инвертиран светлосен микроскоп од Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 и AxioCam MRm, Јена, Германија).
Клиничките податоци беа изразени како средна вредност ± стандардна девијација или медијана (интерквартилен опсег: IQR). Еднонасочна анализа на варијансата (континуирани варијабли) или χ² тестот (категорични варијабли) беа користени за споредување на разликите помеѓу трите студиски групи. Стапката на лажно позитивни резултати (FDR) беше користена за корекција на повеќекратно тестирање, а гените со FDR < 0,05 беа сметани за статистички значајни. Спирмановата корелација беше користена за корелација на метилацијата на CpG ДНК со интензитетот на IPA сигналот, со пријавени номинални p вредности (p < 0,05).
Анализата на патеките беше извршена со помош на веб-базирана алатка за анализа на генски сет (WebGestalt) за 268 транскрипти (номинален p < 0,01), 119 транскрипти поврзани со митохондрии (номинален p < 0,05) и 4350 CpG од 3093 транскрипти на црн дроб кои беа поврзани со нивоата на IPA во серумот во циркулацијата. Беше користена слободно достапната алатка Venny DB (верзија 2.1.0) за пронаоѓање на преклопувачки гени, а StringDB (верзија 11.5) за визуелизација на интеракциите протеин-протеин.
За експериментот LX-2, примероците беа тестирани за нормалност со помош на тестот Д'Агостино-Пирсон. Податоците беа добиени од најмалку три биолошки реплики и подложени на еднонасочна ANOVA со пост-хок тест на Бонферони. p-вредност помала од 0,05 се сметаше за статистички значајна. Податоците се претставени како средна вредност ± SD, а бројот на експерименти е означен на секоја слика. Сите анализи и графикони беа извршени со помош на статистичкиот софтвер GraphPad Prism 8 за Windows (GraphPad Software Inc., верзија 8.4.3, Сан Диего, САД).
Прво, ја испитавме поврзаноста на серумските нивоа на IPA со транскриптите на црниот дроб, целото тело и митохондријалните транскрипти. Во вкупниот профил на транскрипт, најсилниот ген поврзан со серумските нивоа на IPA беше MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; митоген-активирана протеинска киназа-активирана протеинска киназа 3); во профилот на транскрипт поврзан со митохондриите, најсилниот поврзан ген беше AKT1 (FDR = 0,7621; AKT серин/треонин киназа 1) (Дополнителна датотека 1 и Дополнителна датотека 2).
Потоа ги анализиравме глобалните транскрипти (n = 268; p < 0,01) и транскриптите поврзани со митохондриите (n = 119; p < 0,05), на крајот идентификувајќи ја апоптозата како најзначајниот канонски пат (p = 0,0089). За митохондријалните транскрипти поврзани со нивоата на IPA во серумот, се фокусиравме на апоптозата (FDR = 0,00001), митофагијата (FDR = 0,00029) и TNF сигналните патишта (FDR = 0,000006) (Слика 1А, Табела 2 и Дополнителни слики 1А-Б).
Преклопувачка анализа на глобални транскрипти поврзани со митохондрии и метилација на ДНК во човечки црн дроб во врска со нивоата на IPA во серум. A претставува 268 глобални транскрипти, 119 транскрипти поврзани со митохондрии и транскрипти метилирани со ДНК кои се мапирани на 3092 CpG места поврзани со нивоата на IPA во серум (p вредности < 0,01 за глобални транскрипти и метилирана ДНК, и p вредности < 0,05 за митохондријални транскрипти). Главните преклопувачки транскрипти се прикажани во средината (AKT1 и YKT6). B Мапата на интеракција на 13-те гени со највисок резултат на интеракција (0,900) со други гени е конструирана од 56-те преклопувачки гени (регион со црна линија) кои беа значајно поврзани со нивоата на IPA во серум со користење на онлајн алатката StringDB. Зелена: Гени мапирани на клеточната компонента на Генската онтологија (GO): митохондрии (GO:0005739). AKT1 е протеинот со највисок резултат (0,900) за интеракции со други протеини врз основа на податоците (врз основа на анализа на текст, експерименти, бази на податоци и ко-експресија). Мрежните јазли претставуваат протеини, а рабовите претставуваат врски меѓу протеините.
Бидејќи метаболитите на цревната микробиота можат да го регулираат епигенетскиот состав преку метилација на ДНК [32], истражувавме дали нивоата на IPA во серумот се поврзани со метилацијата на ДНК во црниот дроб. Откривме дека двете главни места на метилација поврзани со нивоата на IPA во серумот се во близина на регионот 3 богат со пролин-серин (C19orf55) и членот 6 од семејството на протеини од топлотен шок Б (мал) (HSPB6) (Дополнителна датотека 3). Метилацијата на ДНК на 4350 CpG (p < 0,01) беше во корелација со нивоата на IPA во серумот и беше збогатена со патишта за регулирање на долговечноста (p = 0,006) (Слика 1А, Табела 2 и Дополнителна слика 1C).
За да ги разбереме биолошките механизми што лежат во основата на асоцијациите помеѓу нивоата на IPA во серумот, глобалните транскрипти, транскриптите поврзани со митохондриите и метилацијата на ДНК во човечкиот црн дроб, извршивме анализа на преклопување на гените идентификувани во претходната анализа на патеките (Слика 1А). Резултатите од анализата на збогатување на патеките на 56-те преклопувачки гени (внатре во црната линија на Слика 1А) покажаа дека патеката на апоптоза (p = 0,00029) истакна два гена заеднички за трите анализи: AKT1 и YKT6 (хомолог на YKT6 v-SNARE), како што е прикажано на Веновиот дијаграм (Дополнителна слика 2 и Слика 1А). Интересно е што откривме дека AKT1 (cg19831386) и YKT6 (cg24161647) беа позитивно корелирани со нивоата на IPA во серумот (Дополнителна датотека 3). За да идентификуваме потенцијални протеински интеракции помеѓу генските производи, избравме 13 гени со највисок резултат на заеднички регион (0,900) меѓу 56 преклопувачки гени како влез и конструиравме мапа на интеракција. Според нивото на доверба (маргинална доверба), генот AKT1 со највисок резултат (0,900) беше на врвот (Слика 1Б).
Врз основа на анализата на патеката, откривме дека апоптозата е главниот пат, па затоа испитавме дали третманот со IPA ќе влијае на апоптозата на HSCs in vitro. Претходно покажавме дека различни дози на IPA (10 μM, 100 μM и 1 mM) се нетоксични за LX-2 клетките [15]. Оваа студија покажа дека третманот со IPA од 10 μM и 100 μM го зголемил бројот на одржливи и некротични клетки. Сепак, во споредба со контролната група, одржливоста на клетките се намалила при концентрација од 1 mM IPA, додека стапката на некроза на клетките останала непроменета (Слика 2A, B). Потоа, за да ја пронајдеме оптималната концентрација за индуцирање апоптоза во LX-2 клетките, тестиравме 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA во текот на 24 часа (Слика 2A-E и Дополнителна слика 3A-B). Интересно е што IPA 10 μM и 100 μM ја намалија стапката на апоптоза (%), меѓутоа, IPA 1 mM ја зголеми доцната апоптоза и стапката на апоптоза (%) во споредба со контролата и затоа беше избран за понатамошни експерименти (Слики 2A–D).
IPA индуцира апоптоза на LX-2 клетките. Методот на двојно боење со анексин V и 7-AAD беше користен за квантифицирање на апоптотичната стапка и морфологијата на клетките со проточна цитометрија. BA клетките беа инкубирани со 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA во тек на 24 часа или со F–H TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA во медиум без серум во тек на 24 часа. A: живи клетки (Анексин V -/ 7AAD-); B: некротични клетки (Анексин V -/ 7AAD+); C, F: рани (Анексин V +/ 7AAD-); D, G: доцни (Анексин V+/7AAD.+); E, H: процент на вкупни рани и доцни апоптотични клетки во апоптотичната стапка (%). Податоците се изразени како средна вредност ± SD, n = 3 независни експерименти. Статистичките споредби беа извршени со користење на еднонасочна ANOVA со Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Како што покажавме претходно, 5 ng/ml TGF-β1 може да предизвика активирање на HSC со зголемување на експресијата на класичните маркер гени [15]. LX-2 клетките беа третирани со 5 ng/ml TGF-β1 и 1 mM IPA во комбинација (Сл. 2E–H). Третманот со TGF-β1 не ја промени стапката на апоптоза, меѓутоа, ко-третманот со IPA ја зголеми доцната апоптоза и стапката на апоптоза (%) во споредба со третманот со TGF-β1 (Сл. 2E–H). Овие резултати укажуваат дека 1 mM IPA може да промовира апоптоза во LX-2 клетки независно од индукцијата на TGF-β1.
Понатаму го испитавме ефектот на IPA врз митохондријалната респирација во LX-2 клетките. Резултатите покажаа дека 1 mM IPA ги намали параметрите на стапката на потрошувачка на кислород (OCR): немитохондријална респирација, базална и максимална респирација, истекување на протони и производство на ATP во споредба со контролната група (Слика 3A, B), додека индексот на биоенергетско здравје (BHI) не се промени.
IPA го намалува митохондријалното дишење во LX-2 клетките. Кривата на митохондријалното дишење (OCR) е претставена како параметри на митохондријалното дишење (немитохондријално дишење, базално дишење, максимално дишење, истекување на протони, генерирање на ATP, SRC и BHI). Клетките A и B беа инкубирани со 10 μM, 100 μM и 1 mM IPA во медиум без серум во текот на 24 часа, соодветно. Клетките C и D беа инкубирани со TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA во медиум без серум во текот на 24 часа, соодветно. Сите мерења беа нормализирани на содржината на ДНК со помош на комплетот CyQuant. BHI: индекс на биоенергетско здравје; SRC: капацитет на респираторна резерва; OCR: стапка на потрошувачка на кислород. Податоците се претставени како средна вредност ± стандардна девијација (SD), n = 5 независни експерименти. Статистичките споредби беа извршени со користење на еднонасочна ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; **p < 0,01; и ***p < 0,001
За да се добие поопфатно разбирање на ефектот на IPA врз биоенергетскиот профил на LX-2 клетките активирани со TGF-β1, ја анализиравме митохондријалната оксидативна фосфорилација со OCR (Сл. 3C,D). Резултатите покажаа дека третманот со TGF-β1 може да го намали максималното дишење, респираторниот резервен капацитет (SRC) и BHI во споредба со контролната група (Сл. 3C,D). Покрај тоа, комбинираниот третман го намали базалното дишење, истекувањето на протони и производството на ATP, но SRC и BHI беа значително повисоки од оние третирани со TGF-β1 (Сл. 3C,D).
Исто така, го извршивме „Тестот за фенотип на клеточна енергија“ обезбеден од софтверот Seahorse (Дополнителна слика 4A–D). Како што е прикажано на Дополнителната слика 3B, метаболичките потенцијали и на OCR и на ECAR беа намалени по третманот со TGF-β1, меѓутоа, не беше забележана разлика во групите за комбиниран и IPA третман во споредба со контролната група. Понатаму, и базалните и нивоата на стрес на OCR беа намалени по комбиниран и IPA третман во споредба со контролната група (Дополнителна слика 4C). Интересно е што сличен модел беше забележан со комбинирана терапија, каде што не беше забележана промена во базалните и нивоата на стрес на ECAR во споредба со третманот со TGF-β1 (Дополнителна слика 4C). Кај HSC, намалувањето на митохондријалната оксидативна фосфорилација и способноста на комбинираниот третман да ги обнови SCR и BHI по изложеност на третман со TGF-β1 не го променија метаболичкиот потенцијал (OCR и ECAR). Земени заедно, овие резултати укажуваат дека IPA може да ја намали биоенергетиката кај HSC, што укажува дека IPA може да предизвика понизок енергетски профил што го поместува фенотипот на HSC кон инактивација (Дополнителна слика 4D).
Ефектот на IPA врз митохондријалната динамика беше испитан со користење на тридимензионална квантификација на митохондријалната морфологија и мрежните врски, како и MTR боење (Слика 4 и Дополнителна слика 5). Слика 4 покажува дека, во споредба со контролната група, третманот со TGF-β1 ја намалил средната површина, бројот на гранки, вкупната должина на гранките и бројот на спојувања на гранките (Слика 4A и B) и го променил процентот на митохондриите од сферична во средна морфологија (Слика 4C). Само третманот со IPA го намалил средниот митохондријален волумен и го променил процентот на митохондриите од сферична во средна морфологија во споредба со контролната група (Слика 4A). Спротивно на тоа, сферичноста, средната должина на гранките и митохондријалната активност оценети со MTR зависен од потенцијалот на митохондријалната мембрана (Слика 4A и E) останале непроменети и овие параметри не се разликувале помеѓу групите. Земени заедно, овие резултати сугерираат дека третманот со TGF-β1 и IPA се чини дека ја модулира митохондријалната форма и големина, како и комплексноста на мрежата кај живите LX-2 клетки.
IPA ја менува митохондријалната динамика и изобилството на митохондријална ДНК во LX-2 клетките. A. Репрезентативни конфокални слики од живи LX-2 клетки инкубирани со TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA 24 часа во медиум без серум, кои покажуваат митохондријални мрежи обоени со Mitotracker™ Red CMXRos и јадра обоени сино со DAPI. Сите податоци содржеа најмалку 15 слики по група. Добивме 10 Z-стек слики за секој тип на примерок. Секоја секвенца на Z-оската содржеше 30 парчиња, секое со дебелина од 9,86 μm. Скала: 10 μm. B. Репрезентативни објекти (само митохондрии) идентификувани со примена на адаптивно прагово одредување на сликата. Квантитативна анализа и споредба на митохондријалните морфолошки мрежни врски беа извршени за сите клетки во секоја група. C. Фреквенција на односите на митохондријалната форма. Вредности блиски до 0 означуваат сферични форми, а вредности блиски до 1 означуваат филаментозни форми. D Содржината на митохондријална ДНК (mtDNA) беше определена како што е опишано во Материјали и методи. E Анализата на Mitotracker™ Red CMXRos беше извршена со проточна цитометрија (30.000 настани) како што е опишано во Материјали и методи. Податоците се претставени како средна вредност ± SD, n = 3 независни експерименти. Статистичките споредби беа извршени со користење на еднонасочна ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Потоа ја анализиравме содржината на mtDNA во LX-2 клетките како индикатор за бројот на митохондријали. Во споредба со контролната група, содржината на mtDNA беше зголемена во групата третирана со TGF-β1 (Слика 4D). Во споредба со групата третирана со TGF-β1, содржината на mtDNA беше намалена во групата со комбиниран третман (Слика 4D), што сугерира дека IPA може да ја намали содржината на mtDNA и евентуално бројот на митохондријали, како и митохондријалната респирација (Слика 3C). Покрај тоа, IPA се чинеше дека ја намалува содржината на mtDNA во комбинираниот третман, но не влијаеше на MTR-посредуваната митохондријална активност (Слики 4A–C).
Ја испитавме поврзаноста на IPA со нивоата на mRNA на гените поврзани со фиброза, апоптоза, преживување и митохондријална динамика во LX-2 клетките (Слика 5A–D). Во споредба со контролната група, групата третирана со TGF-β1 покажа зголемена експресија на гени како што се колаген тип I α2 синџир (COL1A2), α-актин на мазни мускули (αSMA), матрична металопротеиназа 2 (MMP2), ткивен инхибитор на металопротеиназа 1 (TIMP1) и ген сличен на динамин 1 (DRP1), што укажува на зголемена фиброза и активација. Понатаму, во споредба со контролната група, третманот со TGF-β1 ги намали нивоата на mRNA на нуклеарниот прегнан X рецептор (PXR), каспаза 8 (CASP8), MAPKAPK3, инхибитор на B-клеточниот α, засилувач на лесен пептид на генот на нуклеарниот фактор κ (NFκB1A) и инхибитор на подгрупата β на киназата на нуклеарниот фактор κB (IKBKB) (Слика 5A–D). Во споредба со третманот со TGF-β1, комбинираниот третман со TGF-β1 и IPA ја намали експресијата на COL1A2 и MMP2, но ги зголеми нивоата на mRNA на PXR, TIMP1, B-клеточен лимфом-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β и IKBKB. Третманот со IPA значително ја намали експресијата на MMP2, Bcl-2-асоциран протеин X (BAX), AKT1, протеин 1 за оптичка атрофија (OPA1) и митохондријален фузионен протеин 2 (MFN2), додека експресијата на CASP8, NFκB1A, NFκB1B и IKBKB беше зголемена во споредба со контролната група. Сепак, не беше пронајдена разлика во експресијата на каспаза-3 (CASP3), фактор 1 на активирање на апоптотична пептидаза (APAF1), митохондријален фузионен протеин 1 (MFN1) и фисионен протеин 1 (FIS1). Заедно, овие резултати сугерираат дека третманот со IPA ја модулира експресијата на гените поврзани со фиброза, апоптоза, преживување и митохондријална динамика. Нашите податоци сугерираат дека третманот со IPA ја намалува фиброзата кај LX-2 клетките; во исто време, го стимулира преживувањето со поместување на фенотипот кон инактивација.
IPA ја модулира експресијата на гените за фибробласти, апоптотици, виталност и митохондријална динамика во клетките LX-2. Хистограмите ја прикажуваат експресијата на mRNA во однос на ендогената контрола (RPLP0 или PPIA) откако клетките LX-2 беа индуцирани со TGF-β1 и IPA во медиум без серум во тек на 24 часа. A означува фибробласти, B означува апоптотични клетки, C означува преживеани клетки, а D означува експресија на гените за митохондријална динамика. Податоците се претставени како средна вредност ± стандардна девијација (SD), n = 3 независни експерименти. Статистичките споредби се извршени со користење на еднонасочна ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Потоа, промените во големината на клетките (FSC-H) и цитоплазматската комплексност (SSC-H) беа оценети со проточна цитометрија (Слика 6A,B), а промените во морфологијата на клетките по третманот со IPA беа оценети со трансмисиона електронска микроскопија (TEM) и фазно контрастна микроскопија (Дополнителна слика 6A-B). Како што се очекуваше, клетките во групата третирана со TGF-β1 се зголемија во големина во споредба со контролната група (Слика 6A,B), покажувајќи класично ширење на груб ендоплазматски ретикулум (ER*) и фаголизозоми (P), што укажува на активирање на хематопоетски матични клетки (HSC) (Дополнителна слика 6A). Сепак, во споредба со групата третирана со TGF-β1, големината на клетките, цитоплазматската комплексност (Слика 6A,B) и содржината на ER* беа намалени во групата со комбиниран третман со TGF-β1 и IPA (Дополнителна слика 6A). Понатаму, третманот со IPA ја намали големината на клетките, цитоплазматската комплексност (сл. 6A, B), содржината на P и ER* (Дополнителна сл. 6A) во споредба со контролната група. Покрај тоа, содржината на апоптотични клетки се зголеми по 24 часа третман со IPA во споредба со контролната група (бели стрелки, Дополнителна сл. 6B). Заедно, овие резултати сугерираат дека 1 mM IPA може да ја стимулира апоптозата на HSC и да ги поништи промените во морфолошките параметри на клетките предизвикани од TGF-β1, со што се регулира големината и комплексноста на клетките, што може да биде поврзано со инактивација на HSC.
IPA ја менува големината на клетките и цитоплазматската комплексност кај LX-2 клетките. Репрезентативни слики од анализа на проточна цитометрија. Анализата користеше стратегија за затворање специфична за LX-2 клетките: SSC-A/FSC-A за дефинирање на клеточната популација, FSC-H/FSC-A за идентификување на дублети и SSC-H/FSC-H за анализа на големината и комплексноста на клетките. Клетките беа инкубирани со TGF-β1 (5 ng/ml) и 1 mM IPA во медиум без серум 24 часа. LX-2 клетките беа дистрибуирани во долен лев квадрант (SSC-H-/FSC-H-), горен лев квадрант (SSC-H+/FSC-H-), долен десен квадрант (SSC-H-/FSC-H+) и горен десен квадрант (SSC-H+/FSC-H+) за анализа на големината и цитоплазматската комплексност на клетките. Б. Морфологијата на клетките беше анализирана со проточна цитометрија користејќи FSC-H (напредно расејување, големина на клетките) и SSC-H (странично расејување, цитоплазматска комплексност) (30.000 настани). Податоците се претставени како средна вредност ± SD, n = 3 независни експерименти. Статистичките споредби беа извршени користејќи еднонасочна ANOVA и Bonferroni post hoc тест. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 и ****p < 0,0001
Цревните метаболити како што е IPA станаа жешка тема на истражување, што укажува дека може да се откријат нови цели во цревната микробиота. Затоа е интересно што IPA, метаболит што го поврзавме со фиброза на црниот дроб кај луѓето [15], се покажа како потенцијално антифибротично соединение кај животински модели [13, 14]. Овде, за прв пат демонстрираме поврзаност помеѓу серумската IPA и глобалната транскриптомика на црниот дроб и метилацијата на ДНК кај дебели лица без дијабетес тип 2 (T2D), истакнувајќи ја апоптозата, митофагијата и долговечноста, како и можен кандидат ген AKT1 што ја регулира хомеостазата на црниот дроб. Друга новина во нашата студија е тоа што ја демонстриравме интеракцијата на третманот со IPA со апоптозата, клеточната морфологија, митохондријалната биоенергетика и динамиката во LX-2 клетките, што укажува на понизок енергетски спектар што го поместува HSC фенотипот кон инактивација, што го прави IPA потенцијален кандидат за подобрување на фиброзата на црниот дроб.
Откривме дека апоптозата, митофагијата и долговечноста се најважните канонски патишта збогатени со гените на црниот дроб поврзани со циркулирачкиот серумски IPA. Нарушувањето на системот за контрола на квалитетот на митохондријата (MQC) може да доведе до митохондријална дисфункција, митофагија и апоптоза, со што се промовира појавата на MASLD [33, 34]. Затоа, можеме да шпекулираме дека IPA може да биде вклучен во одржувањето на клеточната динамика и митохондријалниот интегритет преку апоптоза, митофагија и долговечност во црниот дроб. Нашите податоци покажаа дека два гена се заеднички во трите анализи: YKT6 и AKT1. Вреди да се напомене дека YKT6 е SNARE протеин вклучен во процесот на фузија на клеточната мембрана. Тој игра улога во автофагијата и митофагијата со формирање на иницијациски комплекс со STX17 и SNAP29 на автофагозомот, со што се промовира фузијата на автофагозомите и лизозомите [35]. Понатаму, губењето на функцијата на YKT6 резултира со нарушена митофагија[36], додека зголемената регулација на YKT6 е поврзана со прогресијата на хепатоцелуларен карцином (HCC), покажувајќи зголемено преживување на клетките[37]. Од друга страна, AKT1 е најважниот интерактивен ген и игра важна улога во заболувањата на црниот дроб, вклучувајќи го сигналниот пат PI3K/AKT, клеточниот циклус, клеточната миграција, пролиферацијата, фокалната адхезија, митохондријалната функција и секрецијата на колаген[38–40]. Активираниот сигнален пат PI3K/AKT може да ги активира хематопоетските матични клетки (HSCs), кои се клетките одговорни за производство на екстрацелуларен матрикс (ECM), а неговата дисрегулација може да придонесе за појава и прогресија на фиброза на црниот дроб[40]. Покрај тоа, AKT е еден од клучните фактори за преживување на клетките што ја инхибира апоптозата на клетките зависна од p53, а активирањето на AKT може да биде поврзано со инхибиција на апоптозата на клетките на црниот дроб[41, 42]. Добиените резултати сугерираат дека IPA може да биде вклучена во апоптозата поврзана со митохондриите на црниот дроб преку влијание врз одлуката на хепатоцитите помеѓу влегување во апоптоза или преживување. Овие ефекти може да бидат регулирани од кандидат гени AKT и/или YKT6, кои се критични за хомеостазата на црниот дроб.
Нашите резултати покажаа дека 1 mM IPA индуцира апоптоза и намалено митохондријално дишење во LX-2 клетките независно од третманот со TGF-β1. Вреди да се напомене дека апоптозата е главен пат за решавање на фиброзата и активирање на хематопоетските матични клетки (HSC), а исто така е клучен настан во реверзибилниот физиолошки одговор на фиброзата на црниот дроб [4, 43]. Покрај тоа, обновувањето на BHI во LX-2 клетките по комбинираниот третман обезбеди нови сознанија за потенцијалната улога на IPA во регулирањето на митохондријалната биоенергетика. Во мирување и неактивни услови, хематопоетските клетки нормално ја користат митохондријалната оксидативна фосфорилација за да произведат ATP и имаат ниска метаболичка активност. Од друга страна, активирањето на HSC го подобрува митохондријалното дишење и биосинтеза за да ги компензира енергетските потреби за влегување во гликолитичка состојба [44]. Фактот дека IPA не влијаеше на метаболичкиот потенцијал и ECAR сугерира дека гликолитичкиот пат е помалку приоритетен. Слично на тоа, друга студија покажа дека 1 mM IPA е способен да ја модулира активноста на митохондријалниот респираторен ланец кај кардиомиоцитите, клеточната линија на човечки хепатоцити (Huh7) и ендотелните клетки на човечката умбиликална вена (HUVEC); Сепак, не е пронајден никаков ефект на IPA врз гликолизата кај кардиомиоцитите, што сугерира дека IPA може да влијае на биоенергетиката на други типови клетки [45]. Затоа, шпекулираме дека 1 mM IPA може да дејствува како благ хемиски раздвојувач, бидејќи може значително да ја намали фиброгената генска експресија, клеточната морфологија и митохондријалната биоенергетика без да ја промени количината на mtDNA [46]. Митохондријалните раздвојувачи можат да ја инхибираат фиброзата предизвикана од култура и активирањето на HSC [47] и да го намалат производството на митохондријален ATP регулирано или индуцирано од одредени протеини како што се протеините за раздвојување (UCP) или аденин нуклеотидната транслоказа (ANT). Во зависност од типот на клетка, овој феномен може да ги заштити клетките од апоптоза и/или да ја промовира апоптозата [46]. Сепак, потребни се понатамошни студии за да се разјасни улогата на IPA како митохондријален раздвојувач во инактивацијата на хематопоетските матични клетки.
Потоа истражувавме дали промените во митохондријалната респирација се рефлектираат во митохондријалната морфологија кај живите LX-2 клетки. Интересно е што третманот со TGF-β1 го менува митохондријалниот сооднос од сферичен до среден, со намалено митохондријално разгранување и зголемена експресија на DRP1, клучен фактор во митохондријалната фисија [48]. Понатаму, митохондријалната фрагментација е поврзана со целокупната комплексност на мрежата, а преминот од фузија во фисија е клучен за активирање на хематопоетските матични клетки (HSC), додека инхибицијата на митохондријалната фисија води до апоптоза на HSC [49]. Така, нашите резултати покажуваат дека третманот со TGF-β1 може да предизвика намалување на комплексноста на митохондријалната мрежа со намалено разгранување, што е почесто кај митохондријалната фисија поврзана со активирани хематопоетски матични клетки (HSC). Понатаму, нашите податоци покажаа дека IPA може да го промени соодносот на митохондриите од сферичен до среден облик, со што се намалува експресијата на OPA1 и MFN2. Студиите покажаа дека намалувањето на OPA1 може да предизвика намалување на потенцијалот на митохондријалната мембрана и да предизвика апоптоза на клетките [50]. Познато е дека MFN2 посредува во митохондријалната фузија и апоптоза [51]. Добиените резултати сугерираат дека индукцијата на LX-2 клетките од страна на TGF-β1 и/или IPA се чини дека го модулира обликот и големината на митохондријата, како и состојбата на активација и комплексноста на мрежата.
Нашите резултати покажуваат дека комбинираниот третман на TGFβ-1 и IPA може да ги намали mtDNA и клеточните морфолошки параметри со регулирање на mRNA експресијата на фиброза, апоптоза и гени поврзани со преживување во клетките што избегнуваат апоптоза. Всушност, IPA го намали нивото на mRNA експресија на AKT1 и важни гени за фиброза како што се COL1A2 и MMP2, но го зголеми нивото на експресија на CASP8, што е поврзано со апоптоза. Нашите резултати покажаа дека по третманот со IPA, експресијата на BAX се намали, а експресијата на mRNA на подгрупите на семејството TIMP1, BCL-2 и NF-κB се зголеми, што сугерира дека IPA може да стимулира сигнали за преживување во хематопоетските матични клетки (HSCs) кои избегнуваат апоптоза. Овие молекули можат да дејствуваат како про-преживувачки сигнали во активираните хематопоетски матични клетки, што може да биде поврзано со зголемена експресија на анти-апоптотични протеини (како што е Bcl-2), намалена експресија на про-апоптотичен BAX и комплексна интеракција помеѓу TIMP и NF-κB [5, 7]. IPA ги врши своите ефекти преку PXR, и откривме дека комбинираниот третман со TGF-β1 и IPA ги зголемува нивоата на експресија на PXR mRNA, што укажува на супресија на активирањето на HSC. Познато е дека активираната PXR сигнализација ја инхибира активацијата на HSC и in vivo и in vitro [52, 53]. Нашите резултати покажуваат дека IPA може да учествува во чистењето на активираните HSC преку промовирање на апоптоза, намалување на фиброзата и митохондријалниот метаболизам и подобрување на сигналите за преживување, кои се типични процеси што го претвораат активираниот HSC фенотип во инактивиран. Друго можно објаснување за потенцијалниот механизам и улогата на IPA во апоптозата е тоа што ги чисти нефункционалните митохондрии првенствено преку митофагија (интринзичен пат) и екстринзичниот TNF сигнален пат (Табела 1), кој е директно поврзан со NF-κB сигналниот пат за преживување (Дополнителна слика 7). Интересно е што збогатените гени поврзани со IPA се способни да индуцираат про-апоптотички и про-преживувачки сигнали во апоптотичкиот пат [54], што сугерира дека IPA може да го индуцира апоптотичкиот пат или преживувањето преку интеракција со овие гени. Сепак, како IPA индуцира апоптоза или преживување за време на активирањето на HSC и неговите механистички патишта остануваат нејасни.
IPA е микробен метаболит формиран од триптофан во исхраната преку цревната микробиота. Студиите покажаа дека има антиинфламаторни, антиоксидантни и епигенетски регулаторни својства во цревната средина.[55] Студиите покажаа дека IPA може да ја модулира функцијата на цревната бариера и да го намали оксидативниот стрес, што може да придонесе за неговите локални физиолошки ефекти.[56] Всушност, IPA се транспортира до целните органи преку циркулацијата, и бидејќи IPA дели слична структура на главен метаболит со дериватите на триптофан, серотонин и индол, IPA врши метаболички дејства што резултираат со конкурентни метаболички судбини.[52] IPA може да се натпреварува со метаболитите добиени од триптофан за местата на врзување на ензимите или рецепторите, потенцијално нарушувајќи ги нормалните метаболички патишта. Ова ја нагласува потребата од понатамошни студии за неговата фармакокинетика и фармакодинамика за подобро да се разбере неговиот терапевтски прозорец.[57] Останува да се види дали ова може да се случи и кај хематопоетските матични клетки (HSCs).
Признаваме дека нашата студија има некои ограничувања. За конкретно да ги испитаме асоцијациите поврзани со IPA, ги исклучивме пациентите со дијабетес мелитус тип 2 (T2DM). Признаваме дека ова ја ограничува широката применливост на нашите наоди кај пациенти со дијабетес мелитус тип 2 и напредна болест на црниот дроб. Иако физиолошката концентрација на IPA во човечкиот серум е 1-10 μM [11, 20], концентрацијата од 1 mM IPA беше избрана врз основа на највисоката нетоксична концентрација [15] и највисоката стапка на апоптоза, без разлика во процентот на популацијата на некротични клетки. Иако во оваа студија беа користени супрафизиолошки нивоа на IPA, во моментов нема консензус во врска со ефективната доза на IPA [52]. Иако нашите резултати се значајни, пошироката метаболичка судбина на IPA останува активна област на истражување. Покрај тоа, нашите наоди за поврзаноста помеѓу нивоата на IPA во серумот и метилацијата на ДНК на транскриптите на црниот дроб беа добиени не само од хематопоетски матични клетки (HSC), туку и од ткивата на црниот дроб. Избравме да користиме човечки LX-2 клетки врз основа на нашите претходни наоди од транскриптомската анализа дека IPA е поврзана со активирање на хематопоетски матични клетки (HSC) [15], а HSC се главните клетки вклучени во прогресијата на фиброзата на црниот дроб. Црниот дроб е составен од повеќе типови на клетки, па затоа треба да се земат предвид и други клеточни модели како што е системот за кокултура хепатоцити-HSC-имуни клетки во комбинација со активирање на каспаза и фрагментација на ДНК, како и механизмот на дејство, вклучувајќи го и нивото на протеини, за да се проучи улогата на IPA и неговата интеракција со други типови на клетки на црниот дроб.