Статијата е дел од истражувачката тема „Подобрување на отпорноста на мешунките на патогени и штетници“, погледнете ги сите 5 статии
Предизвикувачкиот агенс на габичната растителна болест некроза Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary користи повеќеслојна стратегија за инфицирање на различни растенија домаќини. Оваа студија предлага употреба на диамин L-орнитин, непротеинска аминокиселина која ја стимулира синтезата на други есенцијални аминокиселини, како алтернативна стратегија за управување со подобрување на молекуларните, физиолошките и биохемиските реакции на Phaseolus vulgaris L. на бела мувла предизвикана од Pseudomonas sclerotiorum. Експериментите in vitro покажаа дека L-орнитинот значително го инхибира мицелијалниот раст на S. pyrenoidosa на начин зависен од дозата. Покрај тоа, може значително да ја намали сериозноста на белата мувла во услови на стаклена градина. Понатаму, L-орнитинот го стимулирал растот на третираните растенија, што укажува дека тестираните концентрации на L-орнитин не биле фитотоксични за третираните растенија. Покрај тоа, L-орнитинот ја зголеми експресијата на неензимски антиоксиданси (вкупно растворливи феноли и флавоноиди) и ензимски антиоксиданси (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) и полифенол оксидаза (PPO)), и ја зголеми експресијата на три гени поврзани со антиоксиданси (PvCAT1, PvSOD и PvGR). Понатаму, in silico анализата откри присуство на претпоставен протеин оксалоацетат ацетилхидролаза (SsOAH) во геномот на S. sclerotiorum, кој беше многу сличен на протеините оксалоацетат ацетилхидролаза (SsOAH) на Aspergillus fijiensis (AfOAH) и Penicillium sp. (PlOAH) во однос на функционалната анализа, конзервираните домени и топологијата. Интересно е што додавањето на L-орнитин во медиум од компирова декстроза (PDB) значително ја намали експресијата на генот SsOAH во мицелиите на S. sclerotiorum. Слично на тоа, егзогената апликација на L-орнитин значително ја намали експресијата на генот SsOAH во габични мицелии собрани од третирани растенија. Конечно, апликацијата на L-орнитин значително го намали лачењето на оксална киселина и во PDB медиумот и во заразените лисја. Како заклучок, L-орнитинот игра клучна улога во одржувањето на редокс статусот, како и во подобрувањето на одбранбениот одговор на заразените растенија. Резултатите од оваа студија можат да помогнат во развојот на иновативни, еколошки методи за контрола на белата мувла и ублажување на нејзиното влијание врз производството на грав и други култури.
Белата мувла, предизвикана од некротрофната габа Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, е разорна болест што го намалува приносот и претставува сериозна закана за глобалното производство на грав (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum е еден од најтешките габични растителни патогени што се пренесуваат во почвата за контрола, со широк спектар на домаќини од над 600 растителни видови и способност за брзо мацерирање на ткивата на домаќинот на неспецифичен начин (Liang and Rollins, 2018). Под неповолни услови, таа поминува низ критична фаза од својот животен циклус, останувајќи неактивна подолг временски период како црни, тврди, структури слични на семе наречени „склероции“ во почвата или како бели, меки израстоци во мицелиумот или вдлабнатината на стеблото на заразените растенија (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum е способен да формира склероции, што му овозможува да преживее на заразени полиња подолг временски период и да опстојува за време на болеста (Schwartz et al., 2005). Склеротиите се богати со хранливи материи, можат да опстојуваат во почвата подолг временски период и да служат како примарен инокулум за последователни инфекции (Schwartz et al., 2005). Под поволни услови, склероциите 'ртат и произведуваат спори што се пренесуваат преку воздух и можат да ги инфицираат сите надземни делови од растението, вклучувајќи, но не ограничувајќи се на цветови, стебла или мешунки (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum користи повеќеслојна стратегија за инфицирање на своите растенија домаќини, која вклучува низа координирани настани од склеротијално ртење до развој на симптоми. Првично, S. sclerotiorum произведува суспендирани спори (наречени аскоспори) од структури слични на печурки наречени апотециуми, кои се пренесуваат во воздух и се развиваат во неподвижни склеротии на заразени растителни остатоци (Bolton et al., 2006). Потоа габата лачи оксална киселина, фактор на вируленција, за да ја контролира pH вредноста на клеточниот ѕид на растението, да ја промовира ензимската деградација и инвазијата на ткивото (Hegedus and Rimmer, 2005) и да го потисне оксидативниот експлозија на растението домаќин. Овој процес на закиселување го ослабува клеточниот ѕид на растението, обезбедувајќи поволна средина за нормално и ефикасно функционирање на ензимите за разградување на клеточниот ѕид на габата (CWDEs), дозволувајќи му на патогенот да ја надмине физичката бариера и да навлезе во ткивата на домаќинот (Marciano et al., 1983). Откако ќе навлезе, S. sclerotiorum лачи голем број на CWDE, како што се полигалактуроназа и целулаза, кои го олеснуваат неговото ширење во заразените ткива и предизвикуваат некроза на ткивата. Прогресијата на лезиите и хифалните подлоги доведува до карактеристични симптоми на бела мувла (Hegedus and Rimmer, 2005). Во меѓувреме, растенијата домаќини препознаваат молекуларни шеми поврзани со патогенот (PAMPs) преку рецептори за препознавање шеми (PRRs), активирајќи серија сигнални настани кои на крајот ги активираат одбранбените одговори.
И покрај децениските напори за контрола на болестите, кај гравот, како и кај другите комерцијални култури, недостигот од соодветна отпорна герминативна плазма останува поради отпорноста, преживувањето и прилагодливоста на патогенот. Затоа, управувањето со болестите е исклучително предизвикувачко и бара интегрирана, повеќеслојна стратегија што вклучува комбинација од културни практики, биолошка контрола и хемиски фунгициди (O'Sullivan et al., 2021). Хемиската контрола на белата мувла е најефикасна бидејќи фунгицидите, кога се применуваат правилно и во вистинско време, можат ефикасно да го контролираат ширењето на болеста, да ја намалат сериозноста на инфекцијата и да ги минимизираат загубите на приносот. Сепак, прекумерната употреба и прекумерната зависност од фунгициди може да доведат до појава на отпорни соеви на S. sclerotiorum и негативно да влијаат на организмите што не се цел, здравјето на почвата и квалитетот на водата (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Затоа, наоѓањето еколошки алтернативи стана врвен приоритет.
Полиамините (PAs), како што се путресцин, спермидин, спермин и кадаверин, можат да послужат како ветувачки алтернативи против растителни патогени што се пренесуваат во почвата, со што целосно или делумно се намалува употребата на опасни хемиски фунгициди (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Кај повисоките растенија, PAs се вклучени во многу физиолошки процеси, вклучувајќи, но не ограничувајќи се на, клеточна делба, диференцијација и одговор на абиотски и биотски стресови (Kiliny and Nehela, 2020). Тие можат да дејствуваат како антиоксиданси, да помогнат во отстранувањето на реактивните кислородни видови (ROS), да ја одржат редокс хомеостазата (Nehela и Killiny, 2023), да индуцираат гени поврзани со одбраната (Romero et al., 2018), да регулираат различни метаболички патишта (Nehela и Killiny, 2023), да модулираат ендогени фитохормони (Nehela и Killiny, 2019), да воспостават системска стекната отпорност (SAR) и да ги регулираат интеракциите помеѓу растенијата и патогените (Nehela и Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Вреди да се напомене дека специфичните механизми и улоги на PA во одбраната на растенијата варираат во зависност од растителниот вид, патогените и условите на животната средина. Најзастапениот PA во растенијата се биосинтетизира од есенцијалниот полиамин L-орнитин (Kiliny и Nehela, 2020).
Л-орнитинот игра повеќекратни улоги во растот и развојот на растенијата. На пример, претходни студии покажаа дека кај оризот (Oryza sativa), орнитинот може да биде поврзан со рециклирање на азот (Liu et al., 2018), принос, квалитет и арома на ориз (Lu et al., 2020) и одговор на воден стрес (Yang et al., 2000). Понатаму, егзогената примена на Л-орнитин значително ја подобри толеранцијата на суша кај шеќерната репка (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) и го ублажи стресот од сол кај растенијата од кромид (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu и Çavuşoǧlu, 2021) и индиски ореви (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Потенцијалната улога на Л-орнитинот во одбраната од абиотски стрес може да се должи на неговата вклученост во акумулацијата на пролин во третираните растенија. На пример, претходно беше објавено дека гените поврзани со метаболизмот на пролин, како што се гените орнитин делта аминотрансфераза (делта-OAT) и пролин дехидрогеназа (ProDH1 и ProDH2), се вклучени во одбраната на Nicotiana benthamiana и Arabidopsis thaliana од соеви на Pseudomonas syringae кои не се домаќини (Senthil-Kumar и Mysore, 2012). Од друга страна, габичната орнитин декарбоксилаза (ODC) е потребна за раст на патогени (Singh et al., 2020). Насочувањето на ODC на Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici преку замолчување на гени предизвикано од домаќинот (HIGS) значително ја зголеми отпорноста на доматите на Fusarium wilting (Singh et al., 2020). Сепак, потенцијалната улога на егзогената примена на орнитин против биотски стресови како што се фитопатогените не е добро проучена. Поважно, ефектите на орнитинот врз отпорноста на болести и поврзаните биохемиски и физиолошки феномени остануваат во голема мера неистражени.
Разбирањето на сложеноста на инфекцијата на мешунките со S. sclerotiorum е важно за развој на ефикасни стратегии за контрола. Во оваа студија, имавме за цел да ја идентификуваме потенцијалната улога на диаминот L-орнитин како клучен фактор во подобрувањето на одбранбените механизми и отпорноста на мешунките на инфекција со Sclerotinia sclerotiorum. Претпоставуваме дека, покрај подобрувањето на одбранбените одговори на заразените растенија, L-орнитинот игра клучна улога и во одржувањето на редокс статусот. Предлагаме дека потенцијалните ефекти на L-орнитинот се поврзани со регулирањето на ензимските и неензимските антиоксидантни одбранбени механизми и интерференцијата со факторите на габична патогеност/вирулентност и поврзаните протеини. Оваа двојна функционалност на L-орнитинот го прави ветувачки кандидат за одржлива стратегија за ублажување на влијанието на белата мувла и подобрување на отпорноста на вообичаените мешунки на овој моќен габичен патоген. Резултатите од оваа студија можат да помогнат во развојот на иновативни, еколошки методи за контрола на белата мувла и ублажување на нејзиното влијание врз производството на мешунки.
Во оваа студија, како експериментален материјал беше користена осетлива комерцијална сорта на обичен грав, Гиза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Здрави семиња беа љубезно обезбедени од Одделот за истражување на мешунки, Институт за истражување на полски култури (FCRI), Земјоделски истражувачки центар (ARC), Египет. Пет семиња беа посеани во пластични саксии (внатрешен дијаметар 35 см, длабочина 50 см) исполнети со почва заразена со S. sclerotiorum во услови на стаклена градина (25 ± 2 °C, релативна влажност 75 ± 1%, 8 часа светлина/16 часа темнина). На 7-10 дена по сеидбата (DPS), садниците беа проретчени за да останат само две садници со униформен раст и три целосно раширени лисја во секоја саксија. Сите растенија во саксии беа наводнувани еднаш на секои две недели и ѓубрени месечно по препорачаната стапка за дадената сорта.
За да се подготви концентрација од 500 mg/L на L-орнитиндиамин (исто така познат како (+)-(S)-2,5-диаминопентаноична киселина; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Германија), 50 mg прво беа растворени во 100 mL стерилна дестилирана вода. Основниот раствор потоа беше разреден и употребен во последователни експерименти. Накратко, шест серии на концентрации на L-орнитин (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L) беа тестирани in vitro. Дополнително, стерилна дестилирана вода беше употребена како негативна контрола (Mock), а комерцијалниот фунгицид „Rizolex-T“ 50% прашок за навлажнување (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Губернија Гарбија, Египет) беше употребен како позитивна контрола. Комерцијалниот фунгицид „Ризолекс-Т“ беше тестиран in vitro во пет концентрации (2, 4, 6, 8 и 10 mg/L).
Примероци од стебла и мешунки од обичен грав кои покажуваа типични симптоми на бела мувла (стапка на инфестација: 10–30%) беа собрани од комерцијални фарми. Иако повеќето од заразените растителни материјали беа идентификувани по вид/сорта (осетлива комерцијална сорта Гиза 3), други, особено оние добиени од локалните пазари, беа од непознат вид. Собраните заразени материјали прво беа површински дезинфицирани со 0,5% раствор на натриум хипохлорит 3 минути, потоа исплакнати неколку пати со стерилна дестилирана вода и избришани со стерилна филтер-хартија за да се отстрани вишокот вода. Инфицираните органи потоа беа исечени на мали парчиња од средното ткиво (помеѓу здравите и заразените ткива), култивирани на компиров декстрозен агар (PDA) медиум и инкубирани на 25 ± 2 °C со 12-часовен циклус светлина/12-часовен темнина во тек на 5 дена за да се стимулира формирање на склероции. Методот на мицелијален врв беше користен и за прочистување на габични изолати од мешани или контаминирани култури. Прочистениот габичен изолат прво беше идентификуван врз основа на неговите културни морфолошки карактеристики, а потоа беше потврдено дека е S. sclerotiorum врз основа на микроскопски карактеристики. Конечно, сите прочистени изолати беа тестирани за патогеност на осетливата сорта на обичен грав Giza 3 за да ги исполнат Коховите постулати.
Дополнително, најинвазивниот изолат на S. sclerotiorum (изолат #3) беше дополнително потврден врз основа на секвенционирање со внатрешен транскрибиран спејсер (ITS) како што е опишано од White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Накратко, изолатите беа култивирани во супа од компир и декстроза (PDB) и инкубирани на 25 ± 2 °C во тек на 5-7 дена. Потоа беше собран габичниот мицелиум, филтриран низ газа, измиен двапати со стерилна вода и сушен со стерилна филтер-хартија. Геномската ДНК беше изолирана со помош на комплетот Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Регионот на ITS rDNA потоа беше амплифициран со користење на специфичниот пар прајмери ​​ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; очекувана големина: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Прочистените PCR производи беа поднесени за секвенционирање (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA секвенците беа секвенционирани двонасочно со користење на методот на секвенционирање на Сангер. Собраните секвенци на барање потоа беа споредени со најновите податоци во GenBank и Националниот центар за биотехнолошки информации (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) со користење на софтверот BLASTn. Секвенцата на пребарување беше споредена со 20 други соеви/изолати на S. sclerotiorum добиени од најновите податоци во NCBI GenBank (Дополнителна табела S1) користејќи ClustalW во Пакетот за анализа на молекуларна еволутивна генетика (MEGA-11; верзија 11) (Kumar et al., 2024). Еволутивната анализа беше извршена со користење на методот на максимална веројатност и општиот временски реверзибилен модел на супституција на нуклеотиди (Nei and Kumar, 2000). Прикажано е дрвото со највисока логаритамска веројатност. Почетното дрво за евристичко пребарување е избрано со избирање на дрвото со повисока логаритамска веројатност помеѓу дрвото за спојување на соседи (NJ) (Kumar et al., 2024) и дрвото за максимална штедливост (MP). Дрвото NJ беше конструирано со користење на матрица на парно растојание пресметана со користење на општиот временски реверзибилен модел (Nei and Kumar, 2000).
Антибактериската активност на L-орнитинот и бактерицидот „Rizolex-T“ беше определена in vitro со метод на агарска дифузија. Метод: Земете соодветна количина од основниот раствор на L-орнитин (500 mg/L) и темелно измешајте ја со 10 ml од PDA хранливата подлога за да подготвите раствори со конечни концентрации од 12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L, соодветно. Пет концентрации на фунгицидот „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 и 10 mg/L) и стерилна дестилирана вода беа употребени како контрола. Откако подлогата се зацврсти, свежо подготвен мицелијален чеп од културата Sclerotinia sclerotiorum, со дијаметар од 4 mm, беше префрлен во центарот на Петриевата шоља и култивиран на 25 ± 2°C додека мицелиумот не ја покрие целата контролна Петриева шоља, по што беше забележан растот на габата. Пресметајте го процентот на инхибиција на радијалниот раст на S. sclerotiorum користејќи ја равенката 1:
Експериментот беше повторен двапати, со шест биолошки повторувања за секоја контролна/експериментална група и пет саксии (две растенија по саксија) за секоја биолошка повторување. Секоја биолошка повторување беше анализирана двапати (две технички повторувања) за да се обезбеди точност, сигурност и репродуктивност на експерименталните резултати. Дополнително, беше користена пробит регресивна анализа за пресметување на полумаксималната инхибиторна концентрација (IC50) и IC99 (Prentice, 1976).
За да се процени потенцијалот на L-орнитинот во услови на стаклена градина, беа спроведени два последователни експерименти со саксии. Накратко, саксиите беа наполнети со стерилизирана глинесто-песоклива почва (3:1) и инокулирани со свежо подготвена култура на S. sclerotiorum. Прво, најинвазивниот изолат на S. sclerotiorum (изолат #3) беше култивиран со сечење на еден склеротиум на половина, поставување со лицето надолу на PDA и инкубирање на 25°C во постојан мрак (24 часа) 4 дена за да се стимулира растот на мицелијата. Потоа беа земени четири агар-чепчиња со дијаметар од 5 mm од предниот раб и инокулирани со 100 g стерилна мешавина од пченични и оризови трици (1:1, v/v) и сите колби беа инкубирани на 25 ± 2 °C под 12-часовен циклус светлина/12-часовен мрак во текот на 5 дена за да се стимулира формирањето на склероции. Содржината на сите колби беше темелно измешана за да се обезбеди хомогеност пред да се додаде почва. Потоа, во секоја саксија се додаваа 100 g од колонизирачката мешавина од трици за да се обезбеди константна концентрација на патогени. Инокулираните садови беа наводнувани за да се активира растот на габите и ставени во стакленички услови 7 дена.
Потоа во секоја саксија беа посеани пет семиња од сортата Гиза 3. За саксиите третирани со L-орнитин и фунгицидот Ризолекс-Т, стерилизираните семиња прво беа потопени два часа во воден раствор од двете соединенија со конечна концентрација на IC99 од околу 250 mg/L и 50 mg/L, соодветно, а потоа сушени на воздух еден час пред сеидбата. Од друга страна, семето беше потопено во стерилна дестилирана вода како негативна контрола. По 10 дена, пред првото наводнување, садниците беа проретчени, оставајќи само два уредни садници во секоја саксија. Дополнително, за да се обезбеди инфекција со S. sclerotiorum, стеблата на грав во иста фаза на развој (10 дена) беа исечени на две различни локации со помош на стерилизиран скалпел и приближно 0,5 g од колонизирачката мешавина од трици беше ставена во секоја рана, проследено со висока влажност за да се стимулира инфекцијата и развојот на болести кај сите инокулирани растенија. Контролните растенија беа слично ранети и еднаква количина (0,5 g) стерилна, неколонизирана мешавина од трици беше ставена во раната и одржувана под висока влажност за да се симулира средина за развој на болеста и да се обезбеди конзистентност помеѓу групите за третман.
Метод на третирање: Садниците од грав беа наводнувани со 500 ml воден раствор на L-орнитин (250 mg/l) или фунгицидот Rizolex-T (50 mg/l) со наводнување на почвата, а потоа третирањето беше повторено три пати во интервал од 10 дена. Контролните групи третирани со плацебо беа наводнувани со 500 ml стерилна дестилирана вода. Сите третирања беа спроведени во услови на стаклена градина (25 ± 2°C, 75 ± 1% релативна влажност и фотопериод од 8 часа светлина/16 часа темнина). Сите саксии беа наводнувани на секои две недели и третирани месечно со избалансирано NPK ѓубриво (20-20-20, со 3,6% сулфур и TE микроелементи; Zain Seeds, Египет) со концентрација од 3–4 g/l со фолијарно прскање според препораките за специфичната сорта и упатствата на производителот. Освен ако не е поинаку наведено, целосно проширени зрели листови (2-ри и 3-ти лист од горе) беа собрани од секоја биолошка реплика 72 часа по третманот (hpt), хомогенизирани, здружени и складирани на -80 °C за понатамошни анализи, вклучувајќи, но не ограничувајќи се на, in situ хистохемиска локализација на индикатори за оксидативен стрес, липидна пероксидација, ензимски и неензимски антиоксиданси и генска експресија.
Интензитетот на инфекцијата со бела мувла се проценуваше неделно 21 ден по инокулацијата (dpi) користејќи скала од 1–9 (Дополнителна табела S2) базирана на скалата Пецолдт и Диксон (1996) модифицирана од Теран и сор. (2006). Накратко, стеблата и гранките на гравот беа испитани почнувајќи од точката на инокулација за да се следи прогресијата на лезиите по должината на интернодулите и јазлите. Потоа беше измерено растојанието на лезијата од точката на инокулација до најоддалечената точка по должината на стеблото или гранката и беше доделен резултат од 1–9 врз основа на локацијата на лезијата, каде што (1) означуваше дека нема видлива инфекција во близина на точката на инокулација, а (2–9) означуваше постепено зголемување на големината на лезијата и прогресија по должината на јазлите/интернодулите (Дополнителна табела S2). Интензитетот на инфекцијата со бела мувла потоа беше конвертиран во процент користејќи ја формулата 2:
Дополнително, површината под кривата на прогресија на болеста (AUDPC) беше пресметана со помош на формулата (Shaner and Finney, 1977), која неодамна беше адаптирана за бело гниење на обичен грав (Chauhan et al., 2020) со помош на равенката 3:
Каде што Yi = сериозноста на болеста во времето ti, Yi+1 = сериозноста на болеста во следното време ti+1, ti = време на првото мерење (во денови), ti+1 = време на следното мерење (во денови), n = вкупен број на временски точки или точки на набљудување. Параметрите на раст на гравот, вклучувајќи ја висината на растението (cm), бројот на гранки по растение и бројот на лисја по растение, беа бележени неделно во текот на 21 ден во сите биолошки повторувања.
Во секоја биолошка репликација, примероци од листови (втор и трет целосно развиен лист од врвот) беа собрани на 45-тиот ден по третманот (15 дена по последниот третман). Секоја биолошка репликација се состоеше од пет саксии (две растенија по саксија). Околу 500 мг од смачканото ткиво беше искористено за екстракција на фотосинтетски пигменти (хлорофил а, хлорофил б и каротеноиди) со употреба на 80% ацетон на 4 °C во темница. По 24 часа, примероците беа центрифугирани и супернатантот беше собран за колориметриско одредување на содржината на хлорофил а, хлорофил б и каротеноиди со употреба на UV-160A спектрофотометар (Shimadzu Corporation, Јапонија) според методот на (Lichtenthaler, 1987) со мерење на апсорпцијата на три различни бранови должини (A470, A646 и A663 nm). Конечно, содржината на фотосинтетски пигменти беше пресметана со користење на следните формули 4-6 опишани од Lichtenthaler (1987).
По 72 часа по третманот (hpt), листовите (вториот и третиот целосно развиен лист од врвот) беа собрани од секоја биолошка реплика за in situ хистохемиска локализација на водород пероксид (H2O2) и супероксиден анјон (O2•−). Секоја биолошка реплика се состоеше од пет саксии (две растенија по саксија). Секоја биолошка реплика беше анализирана во дупликат (две технички реплики) за да се обезбеди точност, сигурност и репродуктивност на методот. H2O2 и O2•− беа определени со употреба на 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Германија) или нитросин тетразолиум (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Германија), соодветно, следејќи ги методите опишани од Ромеро-Пуертас и сор. (2004) и Адам и сор. (1989) со мали модификации. За хистохемиска локализација на H2O2 in situ, листовите беа вакуумски инфилтрирани со 0,1% DAB во 10 mM Tris пуфер (pH 7,8), а потоа инкубирани на собна температура на светлина 60 минути. Лепчињата беа избелени во 0,15% (v/v) TCA во 4:1 (v/v) етанол:хлороформ (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каиро, Египет) и потоа изложени на светлина додека не потемнат. Слично на тоа, вентилите беа вакуумски инфилтрирани со 10 mM калиум фосфат пуфер (pH 7,8) што содржи 0,1 w/v % HBT за хистохемиска локализација на O2•− in situ. Лепчињата беа инкубирани на светлина на собна температура 20 минути, потоа избелени како што е наведено погоре, а потоа осветлени додека не се појават темно сини/виолетови дамки. Интензитетот на добиената кафеава (како индикатор за H2O2) или сино-виолетова (како индикатор за O2•−) боја беше оценет со користење на верзијата на пакетот за обработка на слики ImageJ (http://fiji.sc; пристапено на 7 март 2024 година).
Малондијалдехидот (MDA; како маркер за липидна пероксидација) беше определен според методот на Du и Bramlage (1992) со мали модификации. Листовите од секоја биолошка реплика (втор и трет целосно развиен лист од врвот) беа собрани 72 часа по третманот (hpt). Секоја биолошка реплика вклучуваше пет саксии (две растенија по саксија). Секоја биолошка реплика беше анализирана во дупликат (две технички реплики) за да се обезбеди точност, сигурност и репродуктивност на методот. Накратко, 0,5 g мелено ткиво од лист беше користено за екстракција на MDA со 20% трихлороцетна киселина (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, САД) што содржи 0,01% бутилиран хидрокситолуен (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД). Содржината на MDA во супернатантот потоа беше определена колориметриски со мерење на апсорпцијата на 532 и 600 nm со помош на UV-160A спектрофотометар (Shimadzu Corporation, Јапонија), а потоа изразена како nmol g−1 FW.
За проценка на неензимските и ензимските антиоксиданси, листовите (вториот и третиот целосно развиен лист од врвот) беа собрани од секоја биолошка реплика 72 часа по третманот (hpt). Секоја биолошка реплика се состоеше од пет саксии (две растенија по саксија). Секој биолошки примерок беше анализиран во дупликат (два технички примероци). Два листа беа мелени со течен азот и употребени директно за одредување на ензимски и неензимски антиоксиданси, вкупни аминокиселини, содржина на пролин, генска експресија и квантификација на оксалат.
Вкупните растворливи феноли беа определени со употреба на реагенс Фолин-Чиокалтеу (Sigma-Aldrich, Сент Луис, Мисури, САД) со мали модификации на методот опишан од Кахконен и сор. (1999). Накратко, приближно 0,1 g хомогенизирано ткиво од лист беше екстрахирано со 20 ml 80% метанол во темница 24 часа, а супернатантот беше собран по центрифугирање. 0,1 ml од екстрактот од примерокот беше измешан со 0,5 ml реагенс Фолин-Чиокалтеу (10%), протресен 30 секунди и оставен во темница 5 минути. Потоа, во секоја епрувета беа додадени 0,5 ml 20% раствор на натриум карбонат (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каиро, Египет), темелно измешан и инкубиран на собна температура во темница 1 час. По инкубацијата, апсорпцијата на реакционата смеса беше измерена на 765 nm со помош на UV-160A спектрофотометар (Shimadzu Corporation, Јапонија). Концентрацијата на вкупни растворливи феноли во екстрактите од примероците беше определена со помош на калибрациска крива на гална киселина (Fisher Scientific, Hampton, NH, САД) и изразена како милиграми еквивалент на гална киселина на грам свежа тежина (mg GAE g-1 свежа тежина).
Вкупната содржина на растворливи флавоноиди беше определена според методот на Џеридане и сор. (2006) со мали модификации. Накратко, 0,3 ml од горенаведениот метанолен екстракт беше измешан со 0,3 ml 5% раствор од алуминиум хлорид (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, САД), енергично промешан, а потоа инкубиран на собна температура 5 минути, по што следеше додавање на 0,3 ml 10% раствор од калиум ацетат (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каиро, Египет), темелно измешан и инкубиран на собна температура 30 минути во темница. По инкубацијата, апсорпцијата на реакционата смеса беше измерена на 430 nm со помош на UV-160A спектрофотометар (Shimadzu Corporation, Јапонија). Концентрацијата на вкупни растворливи флавоноиди во екстрактите од примероци беше определена со помош на крива за калибрација на рутин (TCI America, Портланд, Орегон, САД) и потоа изразена како милиграми еквивалент на рутин на грам свежа тежина (mg RE g-1 свежа тежина).
Вкупната содржина на слободни аминокиселини во листовите од грав беше определена со употреба на модифициран реагенс нинхидрин (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, САД) врз основа на методот предложен од Јокојама и Хирамацу (2003) и модифициран од Сан и сор. (2006). Накратко, 0,1 g мелено ткиво беше екстрахирано со пуфер со pH 5,4, а 200 μL од супернатантот беше реагирано со 200 μL нинхидрин (2%) и 200 μL пиридин (10%; Spectrum Chemical, Њу Бранзвик, Њу Џерси, САД), инкубирано во бања со врела вода 30 минути, потоа изладено и измерено на 580 nm со употреба на UV-160A спектрофотометар (Shimadzu Corporation, Јапонија). Од друга страна, пролинот беше определен со методот на Бејтс (Bates et al., 1973). Пролинот беше екстрахиран со 3% сулфосалицилна киселина (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, САД) и по центрифугирањето, 0,5 ml од супернатантот беше измешан со 1 ml глацијална оцетна киселина (Fisher Scientific, Hampton, NH, САД) и нинхидрински реагенс, инкубиран на 90°C 45 минути, изладен и измерен на 520 nm користејќи го истиот спектрофотометар како погоре. Вкупните слободни аминокиселини и пролин во екстрактите од листовите беа одредени со користење на калибрациски криви на глицин и пролин (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, САД), соодветно, и изразени како mg/g свежа тежина.
За да се утврди ензимската активност на антиоксидантните ензими, приближно 500 mg хомогенизирано ткиво беше екстрахирано со 3 ml од 50 mM Tris пуфер (pH 7,8) што содржи 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД) и 7,5% поливинилпиролидон (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД), центрифугирано на 10.000 × g 20 минути во фрижидер (4 °C), а супернатантот (суров ензимски екстракт) беше собран (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Потоа, каталазата (CAT) реагираше со 2 ml од 0,1 M натриум фосфатен пуфер (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САД) и 100 μl од 269 mM H2O2 раствор за да се утврди нејзината ензимска активност според методот на Aebi (1984) со мали модификации (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ензимската активност на гваијакол-зависната пероксидаза (POX) беше одредена со користење на методот на Harrach et al. (2009). (2008) со мали модификации (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) и ензимската активност на полифенол оксидазата (PPO) беше одредена по реакција со 2,2 ml од 100 mM натриум фосфатен пуфер (pH 6,0), 100 μl гвајакол (TCI chemicals, Портланд, Орегон, САД) и 100 μl од 12 mM H2O2. Методот беше малку модифициран од (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Тестот беше извршен по реакција со 3 ml раствор на катехол (Thermo Scientific Chemicals, Волтам, Масачусетс, САД) (0,01 M) свежо подготвен во 0,1 M фосфатен пуфер (pH 6,0). CAT активноста беше мерена со следење на распаѓањето на H2O2 на 240 nm (A240), POX активноста беше мерена со следење на зголемувањето на апсорпцијата на 436 nm (A436), а PPO активноста беше мерена со снимање на флуктуациите на апсорпцијата на 495 nm (A495) на секои 30 секунди во тек на 3 минути со помош на UV-160A спектрофотометар (Шимадзу, Јапонија).
RT-PCR во реално време беше користен за откривање на нивоата на транскриптите на три гени поврзани со антиоксиданси, вклучувајќи пероксизомална каталаза (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), супероксид дисмутаза (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) и глутатион редуктаза (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), во листови од грав (вториот и третиот целосно развиен лист од врвот) 72 часа по последниот третман. Накратко, РНК беше изолирана со користење на Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Кина) според протоколот на производителот. Потоа, cDNA беше синтетизирана со користење на TOP script™ cDNA Synthesis Kit според упатствата на производителот. Прајмерските секвенци на горенаведените три гени се наведени во Дополнителната табела S3. PvActin-3 (пристапен број на GenBank: XM_068616709.1) беше користен како ген за одржување на квалитетот на живот, а релативната генска експресија беше пресметана со користење на методот 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001). Беше демонстрирана стабилност на актинот под биотски стрес (некомпатибилна интеракција помеѓу вообичаените мешунки и антрахнозната габа Colletotrichum lindemuthianum) и абиотски стрес (суша, соленост, ниска температура) (Borges et al., 2012).
Првично извршивме анализа in silico на протеините од оксалоацетат ацетилхидролаза (OAH) на ниво на целиот геном во S. sclerotiorum користејќи ја алатката протеин-протеин BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Накратко, користевме OAH од Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; број на пристапување во GenBank XP_040799428.1; 342 аминокиселини) и Penicillium lagena (PlOAH; таксид: 94218; број на пристапување во GenBank XP_056833920.1; 316 аминокиселини) како секвенци на барање за мапирање на хомологниот протеин во S. sclerotiorum (таксид: 5180). BLASTp беше извршен врз најновите достапни податоци за геномот на S. sclerotiorum во GenBank на веб-страницата на Националниот центар за биотехнолошки информации (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Дополнително, предвидениот ген OAH од S. sclerotiorum (SsOAH) и еволутивната анализа и филогенетското дрво на AfOAH од A. fijiensis CBS 313.89 и PlOAH од P. lagena беа изведени со користење на методот на максимална веројатност во MEGA11 (Tamura et al., 2021) и моделот базиран на матрица JTT (Jones et al., 1992). Филогенетското дрво беше комбинирано со анализата на повеќекратно усогласување на протеинските секвенци на сите предвидени гени OAH (SsOAH) од S. sclerotiorum и секвенцата на пребарување со користење на алатката за усогласување базирана на ограничувања (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos и Agarwala, 2007). Покрај тоа, најдобро совпаѓачките аминокиселински секвенци на SsOAH од S. sclerotiorum беа усогласени со бараните секвенци (AfOAH и PlOAH) (Larkin et al., 2007) користејќи ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), а конзервираните региони во усогласувањето беа визуелизирани користејќи ја алатката ESPript (верзија 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Понатаму, предвидените функционални репрезентативни домени и конзервираните места на S. sclerotiorum SsOAH беа интерактивно класифицирани во различни семејства со помош на алатката InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Конечно, тридимензионалното (3D) моделирање на структурата на предвидениот S. sclerotiorum SsOAH беше извршено со помош на Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) и валидирано со помош на SWISS-MODEL server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Предвидените тридимензионални структури (PDB формат) беа интерактивно визуелизирани со помош на пакетот UCSF-Chimera (верзија 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Квантитативна флуоресцентна PCR во реално време беше употребена за да се одреди транскрипционото ниво на оксалоацетат ацетилхидролаза (SsOAH; GenBank пристапен број: XM_001590428.1) во мицелиите на Sclerotinia sclerotiorum. Накратко, S. sclerotiorum беше инокулиран во колба што содржи PDB и ставен во инкубатор за тресење (модел: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, САД) на 25 ± 2 °C во тек на 24 часа на 150 вртежи во минута и во постојан мрак (24 часа) за да се стимулира растот на мицелијата. Потоа, клетките беа третирани со L-орнитин и фунгицидот Rizolex-T при конечни концентрации на IC50 (приближно 40 и 3,2 mg/L, соодветно), а потоа култивирани уште 24 часа под истите услови. По инкубацијата, културите беа центрифугирани на 2500 вртежи во минута во тек на 5 минути, а супернатантот (габичен мицелиум) беше собран за анализа на генската експресија. Слично, габичниот мицелиум беше собран на 0, 24, 48, 72, 96 и 120 часа по инфекцијата од заразени растенија кои формирале бела мувла и памучен мицелиум на површината на заразените ткива. РНК беше екстрахирана од габичниот мицелиум, а потоа кДНК беше синтетизирана како што е опишано погоре. Прајмерските секвенци за SsOAH се наведени во Дополнителната табела S3. SsActin (број на пристапување во GenBank: XM_001589919.1) беше користен како ген за одржување на состојбата, а релативната генска експресија беше пресметана со користење на методот 2-ΔΔCT (Livak и Schmittgen, 2001).
Оксалната киселина беше определена во компирова декстрозна супа (PDB) и растителни примероци што го содржат габичниот патоген Sclerotinia sclerotiorum според методот на Xu и Zhang (2000) со мали модификации. Накратко, изолатите на S. sclerotiorum беа инокулирани во колби што содржат PDB, а потоа култивирани во инкубатор со тресење (модел I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, САД) на 150 вртежи во минута на 25 ± 2 °C во тек на 3-5 дена во постојан мрак (24 часа) за да се стимулира растот на мицелијата. По инкубацијата, габичната култура прво беше филтрирана низ филтер-хартија Whatman #1, а потоа центрифугирана на 2500 вртежи во минута 5 минути за да се отстрани преостанатиот мицелиум. Супернатантот беше собран и складиран на 4°C за понатамошно квантитативно одредување на оксалат. За подготовка на растителни примероци, приближно 0,1 g фрагменти од растително ткиво беа екстрахирани три пати со дестилирана вода (2 ml секој пат). Потоа примероците беа центрифугирани на 2500 вртежи во минута во тек на 5 минути, супернатантот беше суво филтриран низ филтер-хартија Whatman бр. 1 и собран за понатамошна анализа.
За квантитативна анализа на оксална киселина, реакционата смеса беше подготвена во стаклена епрувета со затворач по следниот редослед: 0,2 ml примерок (или PDB културен филтрат или стандарден раствор на оксална киселина), 0,11 ml бромофенолно сино (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Питсбург, ПА, САД), 0,198 ml 1 M сулфурна киселина (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каиро, Египет) и 0,176 ml 100 mM калиум дихромат (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портланд, Орегон, САД), а потоа растворот беше разреден до 4,8 ml со дестилирана вода, енергично измешан и веднаш ставен во водена бања на 60 °C. По 10 минути, реакцијата беше запрена со додавање на 0,5 ml раствор на натриум хидроксид (NaOH; 0,75 M). Апсорпцијата (A600) на реакционата смеса беше измерена на 600 nm со помош на UV-160 спектрофотометар (Shimadzu Corporation, Јапонија). PDB и дестилирана вода беа користени како контроли за квантификација на филтратите од културите и примероците од растенијата, соодветно. Концентрациите на оксална киселина во филтратите од културите, изразени како микрограми оксална киселина на милилитар PDB медиум (μg.mL−1), и во екстрактите од листовите, изразени како микрограми оксална киселина на грам свежа тежина (μg.g−1 FW), беа определени со помош на калибрациска крива на оксална киселина (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, САД).
Во текот на студијата, сите експерименти беа дизајнирани во целосно рандомизиран дизајн (CRD) со шест биолошки повторувања по третман и пет саксии по биолошка повторување (две растенија по саксија), освен ако не е поинаку наведено. Биолошките повторувања беа анализирани во дупликат (две технички повторувања). Техничките повторувања беа користени за проверка на репродуктивноста на истиот експеримент, но не беа користени во статистичката анализа за да се избегнат лажни повторувања. Податоците беа статистички анализирани со помош на анализа на варијанса (ANOVA), проследена со тест на Tukey-Kramer за искрено значајна разлика (HSD) (p ≤ 0,05). За in vitro експерименти, вредностите на IC50 и IC99 беа пресметани со помош на probit моделот и беа пресметани интервали на доверба од 95%.
Вкупно четири изолати беа собрани од различни полиња со соја во губернацијата Ел Габија, Египет. На PDA медиум, сите изолати произведоа кремасто бел мицелиум кој брзо стана памучно бел (Слика 1А), а потоа беж или кафеав во фазата на склероциум. Склеротиите обично се густи, црни, сферични или неправилни по форма, долги од 5,2 до 7,7 mm и со дијаметар од 3,4 до 5,3 mm (Слика 1Б). Иако четири изолати развија маргинален модел на склеротии на работ на медиумот за култура по 10-12 дена инкубација на 25 ± 2 °C (Слика 1А), бројот на склеротии по плочка беше значително различен меѓу нив (P < 0,001), при што изолатот 3 имаше најголем број на склеротии (32,33 ± 1,53 склеротии по плочка; Сл. 1C). Слично на тоа, изолатот #3 произведе повеќе оксална киселина во PDB отколку другите изолати (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Сл. 1D). Изолатот #3 покажа типични морфолошки и микроскопски карактеристики на фитопатогената габа Sclerotinia sclerotiorum. На пример, на PDA, колониите на изолатот #3 брзо растеа, беа кремасто бели (Слика 1А), обратно беж или светло лосос жолто-кафеави и им беа потребни 6-7 дена на 25 ± 2°C за целосно да ја покријат површината на плоча со дијаметар од 9 cm. Врз основа на горенаведените морфолошки и микроскопски карактеристики, изолатот #3 беше идентификуван како Sclerotinia sclerotiorum.
Слика 1. Карактеристики и патогеност на изолати на S. sclerotiorum од вообичаени мешункасти култури. (A) Мицелијален раст на четири изолати на S. sclerotiorum на PDA медиум, (B) склеротии на четири изолати на S. sclerotiorum, (C) број на склеротии (по плоча), (D) секреција на оксална киселина на PDB медиум (μg.mL−1) и (E) сериозност на болеста (%) на четири изолати на S. sclerotiorum на осетлива комерцијална мешункаста сорта Giza 3 во услови на стаклена градина. Вредностите претставуваат средна вредност ± SD од пет биолошки реплики (n = 5). Различните букви означуваат статистички значајни разлики помеѓу третманите (p < 0,05). (F–H) Типични симптоми на бела мувла се појавија на надземни стебла и силициуми, соодветно, 10 дена по инокулацијата со изолатот #3 (dpi). (I) Еволутивната анализа на регионот на внатрешен транскрибиран спејсер (ITS) на изолатот #3 на S. sclerotiorum беше извршена со користење на методот на максимална веројатност и споредена со 20 референтни изолати/соеви добиени од базата на податоци на Националниот центар за биотехнолошки информации (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Броевите над линиите за групирање ја означуваат покриеноста на регионот (%), а броевите под линиите за групирање ја означуваат должината на гранката.
Понатаму, за да се потврди патогеноста, четири добиени изолати на S. sclerotiorum беа употребени за инокулирање на осетливата комерцијална сорта на грав Giza 3 во услови на стаклена градина, што е во согласност со Коховите постулати (сл. 1E). Иако сите добиени габични изолати беа патогени и можеа да го инфицираат зелениот грав (cv. Giza 3), предизвикувајќи типични симптоми на бела мувла на сите надземни делови (сл. 1F), особено на стеблата (сл. 1G) и мешунките (сл. 1H) 10 дена по инокулацијата (dpi), изолатот 3 беше најагресивниот изолат во два независни експерименти. Изолатот 3 имаше највисока тежина на болеста (%) кај растенијата грав (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 и 76,7 ± 3,1 на 7, 14 и 21 ден по инфекцијата, соодветно; Слика 1F).
Идентификацијата на најинвазивниот изолат #3 на S. sclerotiorum беше дополнително потврдена врз основа на секвенционирање со внатрешен транскрибиран спејсер (ITS) (Сл. 1I). Филогенетската анализа помеѓу изолатот #3 и 20 референтни изолати/соеви покажа голема сличност (>99%) меѓу нив. Вреди да се напомене дека изолатот #3 на S. sclerotiorum (533 bp) има голема сличност со американскиот изолат LPM36 на S. sclerotiorum изолиран од суви семки од грашок (пристапен број на GenBank MK896659.1; 540 bp) и кинескиот изолат YKY211 на S. sclerotiorum (пристапен број на GenBank OR206374.1; 548 bp), кој предизвикува гниење на стеблото кај виолетовата (Matthiola incana), сите од кои се групирани одделно на врвот на дендрограмот (Слика 1I). Новата секвенца е депонирана во базата на податоци на NCBI и е именувана како „Sclerotinia sclerotiorum – изолат YN-25“ (пристапен број на GenBank PV202792). Може да се види дека изолатот 3 е најинвазивниот изолат; затоа, овој изолат е избран за проучување во сите последователни експерименти.
Антибактериската активност на диамин L-орнитин (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Германија) при различни концентрации (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L) против изолатот 3 на S. sclerotiorum беше испитувана in vitro. Вреди да се напомене дека L-орнитинот имал антибактериско дејство и постепено го инхибирал радијалниот раст на хифите на S. sclerotiorum на начин зависен од дозата (Слика 2A, B). При највисоката тестирана концентрација (125 mg/L), L-орнитинот покажал највисока стапка на инхибиција на растот на мицелијата (99,62 ± 0,27%; Слика 2B), што било еквивалентно на комерцијалниот фунгицид Rizolex-T (стапка на инхибиција 99,45 ± 0,39%; Слика 2C) при највисоката тестирана концентрација (10 mg/L), што укажува на слична ефикасност.
Слика 2. Ин витро антибактериска активност на L-орнитин против Sclerotinia sclerotiorum. (A) Споредба на антибактериската активност на различни концентрации на L-орнитин против S. sclerotiorum со комерцијалниот фунгицид Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Стапка на инхибиција (%) на мицелијалниот раст на S. sclerotiorum по третман со различни концентрации на L-орнитин (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 mg/L) или Rizolex-T (2, 4, 6, 8 и 10 mg/L), соодветно. Вредностите претставуваат средна вредност ± SD од пет биолошки реплики (n = 5). Различните букви означуваат статистички разлики помеѓу третманите (p < 0,05). (D, E) Регресивна анализа на Probit моделот на L-орнитин и комерцијален фунгицид Rizolex-T, соодветно. Регресивната линија на пробит моделот е прикажана како непрекината сина линија, а интервалот на доверба (95%) е прикажан како испрекината црвена линија.
Дополнително, беше извршена пробит регресиона анализа, а соодветните графикони се прикажани во Табела 1 и слики 2D,E. Накратко, прифатливата вредност на наклонот (y = 2,92x - 4,67) и поврзаните значајни статистики (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 и p < 0,0001; Слика 2D) на L-орнитинот укажуваат на зголемена антифунгална активност против S. sclerotiorum во споредба со комерцијалниот фунгицид Rizolex-T (y = 1,96x - 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 и p < 0,0001) (Табела 1).
Табела 1. Вредности на полу-максималната инхибиторна концентрација (IC50) и IC99 (mg/l) на L-орнитин и комерцијален фунгицид „Rizolex-T“ против S. sclerotiorum.
Генерално, L-орнитинот (250 mg/L) значително го намали развојот и сериозноста на белата мувла кај третираните растенија од обичен грав во споредба со нетретираните растенија инфицирани со S. sclerotiorum (контрола; Слика 3А). Накратко, иако сериозноста на болеста кај нетретираните инфицирани контролни растенија постепено се зголемуваше (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 и 92,33 ± 3,06%), L-орнитинот значително ја намали сериозноста на болеста (%) во текот на целиот експеримент (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 и 26,36 ± 3,07) на 7, 14 и 21 ден по третманот (dpt), соодветно (Слика 3А). Слично на тоа, кога растенијата од грав инфицирани со S. sclerotiorum беа третирани со 250 mg/L L-орнитин, површината под кривата на прогресија на болеста (AUDPC) се намали од 1274,33 ± 33,13 кај нетретирана контрола на 281,03 ± 7,95, што беше малку пониско од онаа на позитивната контрола 50 mg/L Rizolex-T фунгицид (183,61 ± 7,71; Сл. 3Б). Истиот тренд беше забележан и во вториот експеримент.
Сл. 3. Ефект од егзогена апликација на L-орнитин врз развојот на бело гниење кај грав предизвикано од Sclerotinia sclerotiorum во услови на стаклена градина. (A) Крива на прогресија на болеста кај белата мувла кај грав по третман со 250 mg/L L-орнитин. (B) Површина под кривата на прогресија на болеста (AUDPC) кај белата мувла кај грав по третман со L-орнитин. Вредностите претставуваат средна вредност ± SD од пет биолошки реплики (n = 5). Различните букви означуваат статистички значајни разлики помеѓу третманите (p < 0,05).
Егзогената апликација на 250 mg/L L-орнитин постепено ја зголеми висината на растението (сл. 4A), бројот на гранки по растение (сл. 4B) и бројот на листови по растение (сл. 4C) по 42 дена. Додека комерцијалниот фунгицид Rizolex-T (50 mg/L) имаше најголем ефект врз сите проучувани нутритивни параметри, егзогената апликација на 250 mg/L L-орнитин имаше втор најголем ефект во споредба со нетретираните контроли (сл. 4A–C). Од друга страна, третманот со L-орнитин немаше значаен ефект врз содржината на фотосинтетските пигменти хлорофил а (сл. 4D) и хлорофил б (сл. 4E), но малку ја зголеми вкупната содржина на каротеноиди (0,56 ± 0,03 mg/g тежински) во споредба со негативната контрола (0,44 ± 0,02 mg/g тежински) и позитивната контрола (0,46 ± 0,02 mg/g тежински; сл. 4F). Генерално, овие резултати покажуваат дека Л-орнитинот не е фитотоксичен за третираните мешунки, па дури може да го стимулира нивниот раст.
Сл. 4. Ефект од егзогената апликација на L-орнитин врз карактеристиките на раст и фотосинтетските пигменти на листови од грав инфицирани со Sclerotinia sclerotiorum во услови на стаклена градина. (A) Висина на растението (cm), (B) Број на гранки по растение, (C) Број на листови по растение, (D) Содржина на хлорофил a (mg g-1 fr wt), (E) Содржина на хлорофил b (mg g-1 fr wt), (F) Вкупна содржина на каротеноиди (mg g-1 fr wt). Вредностите се средна вредност ± SD од пет биолошки реплики (n = 5). Различните букви означуваат статистички значајни разлики помеѓу третманите (p < 0,05).
In situ хистохемиската локализација на реактивни кислородни видови (ROS; изразени како водород пероксид [H2O2]) и слободни радикали (изразени како супероксидни анјони [O2•−]) покажа дека егзогената апликација на L-орнитин (250 mg/L) значително ја намалила акумулацијата на H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Сл. 5A) и O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Сл. 5B) во споредба со акумулацијата и на нетретирани заразени растенија (173,31 ± 12,06 и 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, соодветно) и на растенија третирани со 50 mg/L од комерцијалниот фунгицид Rizolex-T (170,12 ± 9,50 и 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, соодветно) на 72 часа. Високи нивоа на H2O2 и O2•− се акумулирале под hpt (сл. 5A, B). Слично на тоа, тестот за малондиалдехид (MDA) базиран на TCA покажа дека растенијата од грав инфицирани со S. sclerotiorum акумулирале повисоки нивоа на MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) во нивните лисја (сл. 5C). Сепак, егзогената апликација на L-орнитин значително ја намалила пероксидацијата на липидите, што е потврдено со намалувањето на содржината на MDA кај третираните растенија (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Сл. 5. Ефект од егзогената апликација на L-орнитин врз главните маркери на оксидативен стрес и неензимски антиоксидантни одбранбени механизми кај листови од грав инфицирани со S. sclerotiorum 72 часа по инфекцијата во услови на стаклена градина. (A) Водород пероксид (H2O2; nmol g−1 FW) на 72 hpt, (B) супероксиден анјон (O2•−; nmol g−1 FW) на 72 hpt, (C) малондиалдехид (MDA; nmol g−1 FW) на 72 hpt, (D) вкупни растворливи феноли (mg GAE g−1 FW) на 72 hpt, (E) вкупни растворливи флавоноиди (mg RE g−1 FW) на 72 hpt, (F) вкупни слободни аминокиселини (mg g−1 FW) на 72 hpt и (G) содржина на пролин (mg g−1 FW) на 72 hpt. Вредностите претставуваат средна вредност ± стандардна девијација (средна вредност ± SD) од 5 биолошки реплики (n = 5). Различните букви означуваат статистички значајни разлики помеѓу третманите (p < 0,05).