Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Инсулинските наночестички (NPs) со висока содржина на оптоварување пронајдоа различни примени во различни дозирни форми. Целта на оваа работа е да се процени ефектот од процесите на сушење со замрзнување и сушење со спреј врз структурата на наночестичките од хитозан натоварени со инсулин, со или без манитол како криопротектор. Исто така, го проценивме квалитетот на овие наночестички со нивно повторно растворање. Пред дехидрацијата, големината на честичките на вкрстено поврзаните наночестички од хитозан/натриум триполифосфат/инсулин беше оптимизирана на 318 nm, PDI беше 0,18, ефикасноста на капсулирање беше 99,4%, а оптоварувањето беше 25,01%. По реконституцијата, сите наночестички, освен оние произведени со метод на сушење со замрзнување без употреба на манитол, ја задржаа својата сферична структура на честичките. Во споредба со наночестичките што содржат манитол дехидрирани со било кој спреј, наночестичките сушени со спреј без манитол, исто така, покажаа најмала средна големина на честичките (376 nm) и највисока содржина на оптоварување. (25,02%) со слична стапка на енкапсулација (98,7%) и PDI (0,20) со техники на сушење или сушење со замрзнување. Исушените наночестички со сушење со распрскување без манитол, исто така, резултираа со најбрзо ослободување на инсулин и највисока ефикасност на клеточно апсорбирање. Оваа работа покажува дека сушењето со распрскување може да дехидрира инсулински наночестички без потреба од криопротектори во споредба со конвенционалните методи на сушење со замрзнување, создавајќи поголем капацитет на полнење, пониски барања за адитиви и значајна предност на оперативните трошоци.
Од неговото откривање во 19221,2,3, инсулинот и неговите фармацевтски препарати ги спасија животите на пациентите со дијабетес тип 1 (Т1ДМ) и дијабетес тип 2 (Т1ДМ). Сепак, поради неговите својства како протеин со висока молекуларна тежина, инсулинот лесно се агрегира, се разградува од протеолитички ензими и се елиминира со ефектот на прв премин. Луѓето со дијагностициран дијабетес тип 1 имаат потреба од инсулински инјекции до крајот на животот. Многу пациенти првично дијагностицирани со дијабетес тип 2, исто така, имаат потреба од долгорочни инсулински инјекции. Дневните инсулински инјекции се сериозен извор на дневна болка и непријатност за овие лица, со негативни ефекти врз менталното здравје. Како резултат на тоа, други форми на администрација на инсулин кои предизвикуваат помалку непријатност, како што е оралната администрација на инсулин, се опширно проучувани5 бидејќи имаат потенцијал да го вратат квалитетот на живот на приближно 5 милијарди луѓе со дијабетес ширум светот.
Технологијата на наночестички обезбеди значителен напредок во обидите за земање орален инсулин4,6,7. Технологијата на наночестички ефикасно го капсулира и штити инсулинот од деградација за целна испорака до специфични места во телото. Сепак, употребата на формулации на наночестички има неколку ограничувања, главно поради проблеми со стабилноста на суспензиите на честичките. Може да се појави одредена агрегација за време на складирањето, што ја намалува биорасположивоста на наночестичките натоварени со инсулин8. Покрај тоа, мора да се земе предвид и хемиската стабилност на полимерната матрица на наночестички и инсулин за да се обезбеди стабилноста на инсулинските наночестички (NPs). Во моментов, технологијата на замрзнување-сушење е златен стандард за создавање стабилни NPs, а воедно и спречување на несакани промени за време на складирањето9.
Сепак, сушењето со замрзнување бара додавање на криопротектори за да се спречи влијанието на сферичната структура на нанопаракуларните супстанци од механичкиот стрес на кристалите од мраз. Ова значително го намалува оптоварувањето со инсулински наночестички по лиофилизација, бидејќи криопротекторот зафаќа поголем дел од тежинскиот сооднос. Затоа, произведените инсулински нанопаракуларни супстанци често се сметаат за несоодветни за производство на формулации во сув прав, како што се орални таблети и орални филмови, поради потребата од големи количини на суви наночестички за да се постигне терапевтскиот прозорец на инсулин.
Сушењето со спреј е добро познат и ефтин процес на индустриско ниво за производство на суви прашоци од течни фази во фармацевтската индустрија10,11. Контролата врз процесот на формирање на честички овозможува правилно капсулирање на неколку биоактивни соединенија12, 13. Понатаму, стана ефикасна техника за подготовка на капсулирани протеини за орална администрација. За време на сушењето со спреј, водата испарува многу брзо, што помага да се одржи ниска температура на јадрото на честичките11,14, овозможувајќи нејзина примена за капсулирање на компоненти чувствителни на топлина. Пред сушењето со спреј, материјалот за обложување треба темелно да се хомогенизира со растворот што ги содржи капсулираните состојки11,14. За разлика од сушењето со замрзнување, хомогенизацијата пред капсулирањето при сушење со спреј ја подобрува ефикасноста на капсулирањето за време на дехидрацијата. Бидејќи процесот на капсулирање со сушење со спреј не бара криопротектори, сушењето со спреј може да се користи за производство на сушени NPs со висока содржина на оптоварување.
Оваа студија известува за производство на нанопаратури со инсулин преку вкрстено поврзување на хитозан и натриум триполифосфат со употреба на метод на јонски гел. Јонската желатинација е метод на подготовка што овозможува производство на наночестички преку електростатски интеракции помеѓу два или повеќе јонски видови под одредени услови. За дехидрација на оптимизираните вкрстено поврзани наночестички од хитозан/натриум триполифосфат/инсулин беа користени техники на сушење со замрзнување и сушење со прскање. По дехидрацијата, нивната морфологија беше анализирана со SEM. Нивната способност за рекомбинација беше оценета со мерење на нивната распределба на големината, површинскиот полнеж, PDI, ефикасноста на капсулација и содржината на оптоварување. Квалитетот на ресолубилизираните наночестички произведени со различни методи на дехидрација беше исто така оценет со споредување на нивната инсулинска заштита, однесувањето на ослободување и ефикасноста на клеточната апсорпција.
pH вредноста на мешаниот раствор и односот на хитозан и инсулин се два клучни фактори кои влијаат на големината на честичките и ефикасноста на енкапсулација (EE) на конечните NPs, бидејќи тие директно влијаат на процесот на јонотропно желирање. pH вредноста на мешаниот раствор покажа висока корелација со големината на честичките и ефикасноста на енкапсулација (Сл. 1а). Како што е прикажано на Сл. 1а, со зголемување на pH вредноста од 4,0 на 6,0, просечната големина на честичките (nm) се намалуваше, а EE значително се зголемуваше, додека кога pH вредноста се зголемуваше на 6,5, просечната големина на честичките почна да се зголемува, а EE остана непроменета. Со зголемување на односот на хитозан кон инсулин, се зголемува и просечната големина на честичките. Понатаму, не е забележана промена во EE кога наночестичките беа подготвени со масен сооднос на хитозан/инсулин поголем од 2,5:1 (w/w) (Сл. 1б). Затоа, оптималните услови за подготовка во оваа студија (pH 6,0, масен сооднос на хитозан/инсулин од 2,5:1) беа употребени за подготовка на наночестички натоварени со инсулин за понатамошно проучување. Под овие услови на подготовка, просечната големина на честичките на инсулинските наночестички беше оптимизирана на 318 nm (Сл. 1c), PDI беше 0,18, ефикасноста на вградување беше 99,4%, зета потенцијалот беше 9,8 mv, а инсулинското оптоварување беше 25,01% (m/m2). Врз основа на резултатите од трансмисионата електронска микроскопија (TEM), оптимизираните наночестички беа грубо сферични и дискретни со релативно униформна големина (Сл. 1d).
Оптимизација на параметрите на инсулинските наночестички: (а) ефектот на pH вредноста врз средниот дијаметар и ефикасноста на енкапсулација (EE) на инсулинските наночестички (подготвени при масен сооднос 5:1 на хитозан и инсулин); (б) хитозан и влијанието на масни сооднос на инсулинот врз средниот дијаметар и ефикасноста на енкапсулација (EE) на инсулинските наночестички (подготвени при pH 6); (в) распределба на големината на честичките на оптимизираните инсулински наночестички; (г) TEM микрографија на оптимизирани инсулински наночестички.
Добро е познато дека хитозанот е слаб полиелектролит со pKa од 6,5. Тој е позитивно наелектризиран во кисели медиуми бидејќи неговата главна амино група е протонирана со водородни јони15. Затоа, често се користи како носач за капсулирање на негативно наелектризирани макромолекули. Во оваа студија, хитозанот беше користен за капсулирање на инсулин со изоелектрична точка од 5,3. Бидејќи хитозанот се користи како материјал за обложување, со зголемување на неговиот сооднос, дебелината на надворешниот слој на наночестичките се зголемува соодветно, што резултира со поголема просечна големина на честичките. Покрај тоа, повисоките нивоа на хитозан можат да капсулираат повеќе инсулин. Во нашиот случај, EE беше највисок кога односот на хитозан и инсулин достигна 2,5:1, и немаше значителна промена во EE кога односот продолжи да се зголемува.
Освен односот на хитозан и инсулин, pH вредноста исто така играше клучна улога во подготовката на NPs. Ган и сор. 17 го проучуваа ефектот на pH врз големината на честичките на хитозанските наночестички. Тие открија континуирано намалување на големината на честичките сè додека pH не достигна 6,0, а значително зголемување на големината на честичките беше забележано при pH > 6,0, што е во согласност со нашите набљудувања. Овој феномен се должи на фактот дека со зголемување на pH вредноста, молекулата на инсулин добива негативен површински полнеж, со што се фаворизираат електростатските интеракции со комплексот хитозан/натриум триполифосфат (TPP), што резултира со мала големина на честичките и висока EE. Меѓутоа, кога pH вредноста беше прилагодена на 6,5, амино групите на хитозанот беа депротонирани, што резултираше со преклопување на хитозанот. Така, високата pH вредност резултира со помала изложеност на амино јони на TPP и инсулин, што резултира со помало вкрстено поврзување, поголема конечна просечна големина на честичките и пониска EE.
Анализата на морфолошките својства на замрзнато-сушените и спреј-сушените нанопаркa може да го води изборот на подобри техники за дехидрација и формирање на прав. Преферираниот метод треба да обезбеди стабилност на лекот, униформна форма на честичките, високо оптоварување со лекот и добра растворливост во оригиналниот раствор. Во оваа студија, за подобро споредување на двете техники, инсулинските нанопаркa со или без 1% манитол беа користени за време на дехидрацијата. Манитолот се користи како средство за зголемување на волуменот или криопротектор во различни формулации на сув прав за замрзнато-сушење и спреј-сушење. За лиофилизираните инсулински наночестички без манитол, како што е прикажано на Слика 2а, беше забележана високо порозна структура на прав со големи, неправилни и груби површини под скенирачка електронска микроскопија (SEM). Малку дискретни честички беа откриени во правот по дехидрацијата (Сл. 2е). Овие резултати покажаа дека повеќето нанопаркa се распаднале за време на замрзнато-сушењето без никаков криопротектор. За замрзнато-сушените и спреј-сушените инсулински наночестички што содржат 1% манитол, беа забележани сферични наночестички со мазни површини (Сл. 2b,d,f,h). Инсулинските наночестички сушени со прскање без манитол останаа сферични, но збрчкани на површината (сл. 2c). Сферичните и збрчканите површини се дополнително дискутирани во тестовите за однесување на ослободување и клеточна апсорпција подолу. Врз основа на видливиот изглед на сушените нанопарковидни нутриенти, и нанопарковидните сушени со прскање без манитол и нанопарковидните сушени со замрзнување и сушени со прскање со манитол дадоа фини прашоци од нанопарковидни нутриенти (сл. 2f,g,h). Колку е поголема површината помеѓу површините на честичките, толку е поголема растворливоста и затоа е поголема стапката на ослободување.
Морфологија на различни дехидрирани инсулински НП: (а) SEM слика на лиофилизирани инсулински НП без манитол; (б) SEM слика на лиофилизирани инсулински НП со манитол; (в) спреј-сушени инсулински НП без манитол SEM слика од ; (г) SEM слика на инсулински НП сушени со спреј со манитол; (д) слика од прашок на лиофилизирани инсулински НП без манитол; (ѓ) слика од лиофилизирани инсулински НП со манитол; (е) Слика од прашок на спреј-сушени инсулински НП без манитол; (ж) слика од прашок на спреј-сушени инсулински НП со манитол.
За време на сушењето со замрзнување, манитолот делува како криопротектор, одржувајќи ги нанопарколичните перничиња (NPs) во аморфна форма и спречувајќи оштетување од кристали мраз19. Спротивно на тоа, нема чекор на замрзнување за време на сушењето со прскање. Затоа, манитолот не е потребен во овој метод. Всушност, нанопарколичните перничиња сушени со прскање без манитол даваат пофини нанопарколички перничиња како што е претходно опишано. Сепак, манитолот сè уште може да дејствува како филер во процесот на сушење со прскање за да им даде на нанопарколичните перничиња посферична структура20 (сл. 2d), што помага да се добие униформно однесување на ослободување на таквите енкапсулирани нанопарколички перничиња. Покрај тоа, јасно е дека некои големи честички може да се детектираат и во нанопарколично сушени и во нанопарколично сушени инсулински нанопарколички перничиња што содржат манитол (сл. 2b,d), што може да се должи на акумулацијата на манитол во јадрото на честичката заедно со енкапсулираниот инсулин. До. Слој од хитозан. Вреди да се напомене дека во оваа студија, за да се осигури дека сферичната структура останува недопрена по дехидрацијата, односот на манитол и хитозан се одржува на 5:1, така што голема количина на филер може да ја зголеми и големината на честичките на исушените NPs.
Спектроскопијата со инфрацрвена атенуирана целосна рефлексија со Фуриеова трансформација (FTIR-ATR) ја карактеризираше физичката мешавина од слободен инсулин, хитозан, хитозан, TPP и инсулин. Сите дехидрирани NPs беа карактеризирани со употреба на FTIR-ATR спектроскопија. Имено, интензитетите на лентите од 1641, 1543 и 1412 cm-1 беа забележани во капсулирани NPs лиофилизирани со манитол и во NPs сушени со прскање со и без манитол (Сл. 3). Како што претходно беше објавено, овие зголемувања на јачината беа поврзани со вкрстено поврзување помеѓу хитозан, TPP и инсулин. Истражувањето на интеракцијата помеѓу хитозан и инсулин покажа дека во FTIR спектрите на наночестички од хитозан натоварени со инсулин, хитозанската лента се преклопуваше со онаа на инсулинот, зголемувајќи го интензитетот на карбонилот (1641 cm-1) и аминскиот (1543 cm-1) појас. Триполифосфатните групи на TPP се поврзани со амониумските групи во хитозанот, формирајќи лента на 1412 cm-1.
FTIR-ATR спектри на слободен инсулин, хитозан, физички мешавини од хитозан/TPP/инсулин и NPs дехидрирани со различни методи.
Понатаму, овие резултати се во согласност со оние прикажани во SEM, кои покажаа дека енкапсулираните NPs останале недопрени и кога биле испрскани и лиофилизирани со манитол, но во отсуство на манитол, само сушењето со прскање произведувало енкапсулирани честички. Спротивно на тоа, FTIR-ATR спектралните резултати на NPs лиофилизирани без манитол беа многу слични на физичката мешавина од хитозан, TPP и инсулин. Овој резултат покажува дека вкрстените врски помеѓу хитозан, TPP и инсулин повеќе не се присутни во NPs лиофилизирани без манитол. Структурата на NPs била уништена за време на сушењето со лиофилизација без криопротектор, што може да се види во резултатите од SEM (Сл. 2а). Врз основа на морфологијата и FTIR резултатите на дехидрираните инсулински NPs, за експерименти за реконституција биле користени само лиофилизирани, спреј-сушени и NPs без манитол, а NPs без манитол поради распаѓањето на NPs без манитол за време на дехидрацијата. Дискутирајте.
Дехидратацијата се користи за долгорочно складирање и повторна обработка во други формулации. Способноста на сувите нанопарацети за реконституција по складирањето е клучна за нивната употреба во различни формулации како што се таблети и филмови. Забележавме дека просечната големина на честичките на инсулинските нанопарацети сушени со спреј во отсуство на манитол се зголемила само малку по реконституцијата. Од друга страна, големината на честичките на инсулинските наночестички сушени со спреј и замрзнато сушени со манитол значително се зголемила (Табела 1). PDI и EE не беа значително променети (p > 0,05) по рекомбинацијата на сите нанопарацети во оваа студија (Табела 1). Овој резултат покажува дека повеќето од честичките останале недопрени по повторното растворање. Сепак, додавањето на манитол резултирало со значително намалено инсулинско оптоварување на лиофилизираните и сушените со спреј наночестички од манитол (Табела 1). Спротивно на тоа, содржината на инсулинско оптоварување на нанопарацети сушени со спреј без манитол останала иста како и претходно (Табела 1).
Добро е познато дека внесувањето на наночестички е критично кога се користи за испорака на лекови. За NPs со ниски внесувања, потребни се многу големи количини на материјал за да се достигне терапевтскиот праг. Сепак, високиот вискозитет на толку високи концентрации на NP доведува до непријатности и тешкотии при орална администрација и инјектирачки формулации, соодветно 22. Покрај тоа, инсулинските NPs може да се користат и за производство на таблети и вискозни биофилмови 23, 24, што бара употреба на големи количини на NPs при ниски нивоа на внесување, што резултира со големи таблети и дебели биофилмови кои не се погодни за орална апликација. Затоа, дехидрираните NPs со високо инсулинско оптоварување се многу пожелни. Нашите резултати сугерираат дека високото инсулинско оптоварување на NPs сушени со прскање без манитол може да понуди многу привлечни предности за овие алтернативни методи на испорака.
Сите дехидрирани нанопаркa беа чувани во фрижидер три месеци. Резултатите од SEM покажаа дека морфологијата на сите дехидрирани нанопаркa не се променила значително за време на тримесечното складирање (Сл. 4). По реконституцијата во вода, сите нанопаркa покажаа мало намалување на EE и ослободија приближно мала количина (~5%) инсулин за време на тримесечниот период на складирање (Табела 2). Сепак, просечната големина на честичките на сите наночестички се зголеми. Големината на честичките на нанопаркaта сушени со прскање без манитол се зголеми на 525 nm, додека онаа на нанопаркaта сушени со прскање и замрзнато сушени нанопаркaта со манитол се зголеми на 872 и 921 nm, соодветно (Табела 2).
Морфологија на различни дехидрирани инсулински NPs складирани три месеци: (а) SEM слика на лиофилизирани инсулински NPs со манитол; (б) SEM слика на инсулински наночестички сушени со спреј без манитол; (в) без манитол SEM слики на инсулински NPs сушени со спреј.
Понатаму, беа забележани талози во реконституираните инсулински наночестички сушени со прскање со манитол и сушени со замрзнување (Сл. S2). Ова може да биде предизвикано од големи честички кои не се правилно суспендирани во водата. Сите горенаведени резултати покажуваат дека техниката на сушење со прскање може да ги заштити инсулинските наночестички од дехидратација и дека може да се добијат големи оптоварувања со инсулински наночестички без никакви полнила или криопротектори.
Задржувањето на инсулин беше тестирано во pH = 2,5 средина со пепсин, трипсин и α-химотрипсин за да се демонстрира заштитната способност на НП против ензимско варење по дехидрација. Задржувањето на инсулин кај дехидрираните НП беше споредено со она кај свежо подготвените НП, а слободниот инсулин беше користен како негативна контрола. Во оваа студија, слободниот инсулин покажа брза елиминација на инсулин во рок од 4 часа во сите три ензимски третмани (Сл. 5a-c). Спротивно на тоа, тестирањето за елиминација на инсулин кај НП сушени со замрзнување со манитол и НП сушени со прскање со или без манитол покажа значително поголема заштита на овие НП од ензимско варење, што беше слично на онаа кај свежо подготвените НП инсулин (слика 1).5a-c). Со помош на наночестички во пепсин, трипсин и α-химотрипсин, повеќе од 50%, 60% и 75% од инсулинот можеше да се заштити во рок од 4 часа, соодветно (Сл. 5a-c). Оваа способност за заштита на инсулин може да ја зголеми шансата за поголема апсорпција на инсулин во крвотокот25. Овие резултати сугерираат дека сушењето со спреј со или без манитол и сушењето со замрзнување со манитол може да ја зачува инсулинската заштитна способност на НП по дехидрација.
Заштита и однесување на ослободување на дехидрирани инсулински НП: (а) заштита на инсулин во раствор на пепсин; (б) заштита на инсулин во раствор на трипсин; (в) заштита на инсулин со раствор на α-химотрипсин; (г) однесување на ослободување на дехидрирани НП во раствор со pH = 2,5; (д) однесување на ослободување на дехидрирани НП во раствор со pH = 6,6; (ѓ) однесување на ослободување на дехидрирани НП во раствор со pH = 7,0.
Свежо подготвените и реконституирани суви инсулински NPs беа инкубирани во различни пуфери (pH = 2,5, 6,6, 7,0) на 37 °C, симулирајќи ја pH средината на желудникот, дуоденумот и горниот дел од тенкото црево, за да се испита ефектот на инсулинот врз инсулинската резистенција. Однесување на ослободување во различни средини. Фрагмент од гастроинтестиналниот тракт. При pH = 2,5, NPs натоварени со инсулин и ресолубилизирани суви инсулински NPs покажаа почетно ослободување нагло во првиот еден час, проследено со бавно ослободување во текот на следните 5 часа (Сл. 5d). Ова брзо ослободување на почетокот најверојатно е резултат на брза површинска десорпција на протеински молекули кои не се целосно имобилизирани во внатрешната структура на честичката. При pH = 6,5, NPs натоварени со инсулин и реконституираните суви инсулински NPs покажаа мазно и бавно ослободување во текот на 6 часа, бидејќи pH вредноста на тест растворот беше слична на онаа на растворот подготвен со NPs (Сл. 5e). При pH = 7, NPs беа нестабилни и речиси целосно се распаднаа во текот на првите два часа (Сл. 5f). Ова е затоа што депротонацијата на хитозанот се јавува при повисока pH вредност, што резултира со помалку компактна полимерна мрежа и ослободување на натоварен инсулин.
Понатаму, инсулинските NPs сушени со спреј без манитол покажаа побрз профил на ослободување од другите дехидрирани NPs (сл. 5d–f). Како што беше претходно опишано, реконституираните инсулински NPs сушени без манитол покажаа најмала големина на честичките. Малите честички обезбедуваат поголема површина, така што поголемиот дел од релевантниот лек ќе биде на или близу до површината на честичките, што резултира со брзо ослободување на лекот26.
Цитотоксичноста на NPs беше испитана со MTT тест. Како што е прикажано на Слика S4, се покажа дека сите дехидрирани NPs немаат значаен ефект врз одржливоста на клетките при концентрации од 50-500 μg/ml, што укажува дека сите дехидрирани NPs можат безбедно да се користат за да се достигне терапевтскиот прозорец.
Црниот дроб е главниот орган преку кој инсулинот ги извршува своите физиолошки функции. HepG2 клетките се клеточна линија на човечки хепатом која најчесто се користи како модел на апсорпција на хепатоцити in vitro. Овде, HepG2 клетките беа користени за да се процени клеточната апсорпција на дехидрирани NPs со користење на методи на сушење со замрзнување и сушење со прскање. Клеточната апсорпција со конфокално ласерско скенирање со употреба на проточна цитометрија и визија по неколку часа инкубација со слободен FITC инсулин со концентрација од 25 μg/mL, свежо подготвени NPs натоварени со инсулин со FITC и дехидрирани NPs натоварени со инсулин со FITC при еднакви концентрации на инсулин. Беа извршени квантитативни микроскопски набљудувања (CLSM). Лиофилизираните NPs без манитол беа уништени за време на дехидрацијата и не беа оценети во овој тест. Интензитетот на интрацелуларната флуоресценција на свежо подготвените NPs натоварени со инсулин, лиофилизираните NPs со манитол и сушените NPs со и без манитол (Сл. 6а) беа 4,3, 2,6, 2,4 и 4,1 пати повисоки од слободните. FITC-инсулинска група, соодветно (Сл. 6б). Овие резултати сугерираат дека енкапсулираниот инсулин е помоќен во клеточната апсорпција од слободниот инсулин, главно поради помалата големина на наночестичките натоварени со инсулин произведени во студијата.
Апсорпција од клетките HepG2 по 4 часа инкубација со свежо подготвени NPs и дехидрирани NPs: (a) Распределба на апсорпцијата на FITC-инсулин од страна на клетките HepG2. (b) Геометриска средна вредност на интензитетите на флуоресценција анализирана со проточна цитометрија (n = 3), *P < 0,05 во споредба со слободниот инсулин.
Слично на тоа, сликите од CLSM покажаа дека интензитетите на FITC флуоресценцијата на свежо подготвените NPs натоварени со FITC-инсулин и NPs натоварени со FITC-инсулин сушени со спреј (без манитол) беа многу посилни од оние на другите примероци (Сл. 6а). Понатаму, со додавањето на манитол, повисокиот вискозитет на растворот ја зголеми отпорноста на клеточната апсорпција, што резултираше со намалена пролиферација на инсулин. Овие резултати сугерираат дека NPs сушени со спреј без манитол покажаа највисока ефикасност на клеточната апсорпција бидејќи нивната големина на честичките беше помала од онаа на замрзнато-сушените NPs по повторното растворање.
Хитозан (просечна молекуларна тежина 100 KDa, 75–85% деацетилиран) беше купен од Sigma-Aldrich (Оквил, Онтарио, Канада). Натриум триполифосфат (TPP) беше купен од VWR (Раднор, Пенсилванија, САД). Рекомбинантниот човечки инсулин што се користеше во оваа студија беше од Fisher Scientific (Волтам, Масачусетс, САД). Хуман инсулин обележан со флуоресцеин изотиоцијанат (FITC) и 4′,6-диамидино-2-фенилиндол дихидрохлорид (DAPI) беа купени од Sigma-Aldrich (Оквил, Онтарио, Канада). Клеточната линија HepG2 беше добиена од ATCC (Манасас, Вирџинија, САД). Сите други реагенси беа од аналитички или хроматографски квалитет.
Подгответе раствор од CS од 1 mg/ml со растворање во двојно дестилирана вода (DD вода) што содржи 0,1% оцетна киселина. Подгответе раствори од 1 mg/ml на TPP и инсулин со растворање во DD вода и 0,1% оцетна киселина, соодветно. Пре-емулзијата е подготвена со брз хомогенизатор polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, САД). Процесот на подготовка е како што следува: прво, 2 ml раствор од TPP се додаваат во 4 ml раствор од инсулин, а смесата се меша 30 минути и целосно се меша. Потоа, измешаниот раствор се додава капка по капка во растворот од CS преку шприц под мешање со голема брзина (10.000 вртежи во минута). Смесите се чуваат под мешање со голема брзина (15.000 вртежи во минута) во ледена бања 30 минути и се прилагодуваат на одредена pH вредност за да се добијат вкрстено поврзани инсулински NPs. За понатамошно хомогенизирање и намалување на големината на честичките на инсулинските NPs, тие беа соникирани дополнителни 30 минути. во ледена бања со помош на соникатор од типот на сонда (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Германија).
Инсулинските NPS беа тестирани за Z-просечен дијаметар, индекс на полидисперзија (PDI) и зета потенцијал користејќи мерења на динамичко расејување на светлината (DLS) користејќи Litesizer 500 (Антон Паар, Грац, Австрија) со нивно разредување во DD вода на 25°C. Морфологијата и распределбата на големината беа карактеризирани со трансмисионен електронски микроскоп (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Токио, Јапонија), а сликите последователно беа анализирани користејќи софтвер за снимање Hitachi (Hitachi, Токио, Јапонија). За да се процени ефикасноста на енкапсулацијата (EE) и капацитетот на полнење (LC) на инсулинските NP, NP беа пипетирани во ултрафилтрациони цевки со гранична молекуларна тежина од 100 kDa и центрифугирани на 500 xg 30 минути. Неенкапсулираниот инсулин во филтратот беше квантифициран користејќи HPLC систем Agilent 1100 Series (Agilent, Санта Клара, Калифорнија, САД) кој се состои од кватернерна пумпа, автосемплер, грејач на колона и DAD детектор. Инсулинот беше анализиран со C18 колона (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, САД) и детектиран на 214 nm. Мобилната фаза беше ацетонитрил и вода, која содржи 0,1% TFA, градиентни односи од 10/90 до 100/0, и работеше 10 минути. Мобилната фаза беше пумпана со брзина на проток од 1,0 ml/min. Температурата на колоната беше поставена на 20 °C. Пресметајте ги процентите на EE и LC користејќи ги равенките (1) и равенката (2).
За оптимизирање на инсулинските NPs беа тестирани различни соодноси CS/инсулин, во опсег од 2,0 до 4,0. Различни количини на CS раствор беа додадени за време на подготовката, додека мешавината инсулин/TPP беше одржувана константна. Инсулинските NPs беа подготвени во pH опсег од 4,0 до 6,5 со внимателно контролирање на pH вредноста на смесата по додавањето на сите раствори (инсулин, TPP и CS). ЕЕ и големината на честичките на инсулинските наночестички беа оценети при различни pH вредности и масни соодноси CS/инсулин за да се оптимизира формирањето на инсулински NPs.
Оптимизираните инсулински NPs беа поставени на алуминиумски сад и покриени со марамче затегнато со малку селотејп. Последователно, навртуваните садови беа поставени во машина за замрзнување Labconco FreeZone (Labconco, Канзас Сити, Мисури, САД) опремена со сушара во облик на послужавник. Температурата и вакуумскиот притисок беа поставени на -10 °C, 0,350 Torr за првите 2 часа и 0 °C и 0,120 Torr за преостанатите 22 часа од 24 часа за да се добијат суви инсулински NPs.
За генерирање на капсулиран инсулин беше користен мини сушач за прскање Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Швајцарија). Избраните параметри на сушење беа: температура 100 °C, проток на храна 3 L/min и проток на гас 4 L/min.
Инсулинските нанопаркови пред и по дехидрацијата беа карактеризирани со употреба на FTIR-ATR спектроскопија. Дехидрираните наночестички, како и слободниот инсулин и хитозан, беа анализирани со употреба на Spectrum 100 FTIR спектрофотометар (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) опремен со универзален ATR додаток за земање примероци (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Просечните вредности на сигналот беа добиени од 16 скенирања со резолуција од 4 cm2 во фреквентен опсег од 4000-600 cm2.
Морфологијата на сувите инсулински NPs беше оценета со SEM слики од замрзнато-сушени и спреј-сушени инсулински NPs снимени со помош на Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Хилсборо, Орегон, САД). Главниот користен параметар беше напон 5 keV и струја 30 mA.
Сите дехидрирани инсулински NPs беа повторно растворени во dd вода. Големината на честичките, PDI, EE и LC беа тестирани повторно со користење на истиот метод споменат претходно за да се процени нивниот квалитет по дехидрацијата. Стабилноста на анхидроинсулинските NPs беше измерена и со тестирање на својствата на NPs по продолжено складирање. Во оваа студија, сите NPs по дехидрацијата беа складирани во фрижидер три месеци. По три месеци складирање, NPs беа тестирани за морфолошка големина на честичките, PDI, EE и LC.
Растворете 5 mL реконституирани NPs во 45 mL што содржи симулирана гастрична течност (pH 1,2, што содржи 1% пепсин), цревна течност (pH 6,8, што содржи 1% трипсин) или раствор на химотрипсин (100 g/mL, во фосфатен пуфер, pH 7,8) за да ја процените ефикасноста на инсулинот во заштитата на NPs по дехидратација. Тие беа инкубирани на 37°C со брзина на мешање од 100 вртежи во минута. 500 μL од растворот беа собрани во различни временски точки и концентрацијата на инсулин беше одредена со HPLC.
Однесувањето на ослободувањето in vitro на свежо подготвени и дехидрирани инсулински NPs беше тестирано со методот на дијализна кеса (гранична молекуларна тежина 100 kDa, Spectra Por Inc.). Свежо подготвените и реконституирани суви NPs беа дијализирани во течности со pH 2,5, pH 6,6 и pH 7,0 (0,1 M фосфатно-пуфериран физиолошки раствор, PBS) за да се симулира pH средината на желудникот, дуоденумот и горниот дел од тенкото црево, соодветно. Сите примероци беа инкубирани на 37 °C со континуирано тресење на 200 вртежи во минута. Аспирирајте ја течноста надвор од дијализната кеса од 5 mL во следните времиња: 0,5, 1, 2, 3, 4 и 6 часа и веднаш надополнете го волуменот со свеж дијализат. Контаминацијата со инсулин во течноста беше анализирана со HPLC, а стапката на ослободување на инсулин од наночестичките беше пресметана од односот на ослободениот слободен инсулин кон вкупниот инсулин инкапсулиран во наночестичките (равенка 3).
Клеточните клетки од хепатоцелуларен карцином на човекот, HepG2, беа одгледувани во садови со дијаметар од 60 mm користејќи Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) кој содржи 10% фетален говедски серум, 100 IU/mL пеницилин и 100 μg/mL стрептомицин29. Културите беа одржувани на 37°C, 95% релативна влажност и 5% CO2. За тестови за апсорпција, HepG2 клетките беа засеани со 1 × 105 клетки/ml на систем со слајдови од комора Nunc Lab-Tek со 8 бунари (Thermo Fisher, NY, САД). За тестови за цитотоксичност, тие беа засеани во плочи со 96 бунари (Corning, NY, САД) со густина од 5 × 104 клетки/ml.
MTT тестот беше користен за да се процени цитотоксичноста на свежо подготвените и дехидрирани инсулински NPs30. HepG2 клетките беа засеани во плочи со 96 бунари со густина од 5 × 104 клетки/mL и култивирани 7 дена пред тестирањето. Инсулинските NPs беа разредени до различни концентрации (50 до 500 μg/mL) во културен медиум, а потоа администрирани во клетките. По 24 часа инкубација, клетките беа измиени 3 пати со PBS и инкубирани со медиум што содржи 0,5 mg/ml MTT дополнителни 4 часа. Цитотоксичноста беше оценета со мерење на ензимската редукција на жолтиот тетразолиум MTT во виолетов формазан на 570 nm со помош на Tecan infinite M200 pro спектрофотометарски читач на плочи (Tecan, Männedorf, Швајцарија).
Ефикасноста на клеточната апсорпција на NPs беше тестирана со конфокална ласерска скенирачка микроскопија и анализа на проточна цитометрија. Секоја бунар од системот за слајд-комора Nunc Lab-Tek беше третирана со слободен FITC-инсулин, NPs натоварени со FITC-инсулин и реконституирани 25 μg/mL дехидрирани NPs со FITC-инсулин со иста концентрација и инкубирани 4 часа. Клетките беа измиени 3 пати со PBS и фиксирани со 4% параформалдехид. Јадрата беа обоени со 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Локализацијата на инсулин беше забележана со помош на конфокален микроскоп за ласерско скенирање/двофотонски микроскоп Olympus FV1000 (Olympus, Шинџуку Сити, Токио, Јапонија). За анализа на проточна цитометрија, истите концентрации од 10 μg/mL слободен FITC-инсулин, NPs натоварени со FITC-инсулин и ресолубилизирани дехидрирани NPs со FITC-инсулин беа додадени во Плочи со 96 бунари беа засеани со HepG2 клетки и инкубирани 4 часа. По 4 часа инкубација, клетките беа отстранети и измиени 3 пати со FBS. 5 × 104 клетки по примерок беа анализирани со проточен цитометар BD LSR II (BD, Франклин Лејкс, Њу Џерси, САД).
Сите вредности се изразени како средна вредност ± стандардна девијација. Споредбите меѓу сите групи беа оценети со користење на еднонасочна ANOVA или t-тест од IBM SPSS Statistics 26 за Mac (IBM, Endicott, Њујорк, САД) и p < 0,05 се сметаше за статистички значајно.
Оваа студија ја демонстрира флексибилноста и способноста на сушењето со спреј за дехидрирање на вкрстено поврзани хитозан/TPP/инсулин наночестички со подобра реконституција во споредба со стандардните методи на сушење со замрзнување со употреба на средства за зголемување на волуменот или криопротектори и поголем капацитет на оптоварување. Оптимизираните инсулински наночестички дадоа просечна големина на честички од 318 nm и ефикасност на капсулирање од 99,4%. Резултатите од SEM и FTIR по дехидрацијата покажаа дека сферичната структура е задржана само кај спреј-сушени NPs со и без манитол и лиофилизирани со манитол, но лиофилизираните NPs без манитол беа распаднати за време на дехидрацијата. Во тестот за способност за реконституција, инсулинските наночестички сушени со спреј без манитол покажаа најмала средна големина на честички и најголемо оптоварување по реконституцијата. Однесувањето на ослободување на сите овие дехидрирани NPs покажа дека тие брзо се ослободуваат во раствори со pH = 2,5 и pH = 7, и многу стабилни во раствор со pH = 6,5. Во споредба со други ретрастворени дехидрирани NPs, НП сушени со спреј без манитол покажаа најбрзо ослободување. Овој резултат е во согласност со оној забележан во тестот за клеточна апсорпција, бидејќи НП сушени со спреј во отсуство на манитол речиси целосно ја одржуваат ефикасноста на клеточната апсорпција на свежо подготвените НП. Овие резултати сугерираат дека сувите инсулински наночестички подготвени со сушење со спреј без манитол се најсоодветни за понатамошна обработка во други безводни дозирни форми, како што се орални таблети или биоадхезивни филмови.
Поради проблеми со интелектуалната сопственост, множествата податоци генерирани и/или анализирани за време на тековната студија не се јавно достапни, но се достапни од соодветните автори по разумно барање.
Каган, А. Дијабетес тип 2: социјално и научно потекло, медицински компликации и импликации за пациентите и другите. (Мекфарлан, 2009).
Синг, АП, Гуо, Ј., Синг, А., Сие, В. и Џијанг, П. Развој на инсулинска енкапсулација: дали сега е можна орална администрација? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. и Dass, CR Неодамнешни достигнувања во системите за орална испорака на липозоми натоварени со инсулин за третман на дијабетес. Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).