Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена CSS поддршка. За најдобри резултати, препорачуваме да користите понова верзија на вашиот прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилизирање или JavaScript.
Пропионската киселина (PPA) се користи за проучување на улогата на митохондријалната дисфункција кај невроразвојните нарушувања како што е нарушувањето на спектарот на аутизам. Познато е дека PPA ја нарушува митохондријалната биогенеза, метаболизмот и прометот. Сепак, ефектите на PPA врз митохондријалната динамика, фисијата и фузијата остануваат проблематични поради сложената временска природа на овие механизми. Овде, користиме комплементарни техники на квантитативно снимање за да истражиме како PPA влијае на митохондријалната ултраструктура, морфологија и динамика во клетките SH-SY5Y слични на неврони. PPA (5 mM) предизвика значително намалување на митохондријалната површина (p < 0,01), дијаметарот и обемот на Ферет (p < 0,05) и површината 2 (p < 0,01). Анализата на локаторот на митохондријалните настани покажа значително зголемување (p < 0,05) на настаните на фисија и фузија, со што се одржува интегритетот на митохондријалната мрежа под услови на стрес. Покрај тоа, експресијата на mRNA на cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) и OPA1 (p < 0,05) беше значително намалена. 01). Ова го илустрира ремоделирањето на митохондријалната морфологија, биогенезата и динамиката за одржување на функцијата под услови на стрес. Нашите податоци даваат нов увид во ефектите на PPA врз митохондријалната динамика и ја истакнуваат корисноста на техниките за снимање за проучување на сложените регулаторни механизми вклучени во митохондријалните одговори на стрес.
Митохондриите се составен дел од различните клеточни функции, покрај нивните типични улоги во производството на енергија и биосинтезата. Митохондријалниот метаболизам е клучен регулатор на калциумовата сигнализација, метаболичката и редокс хомеостазата, воспалителната сигнализација, епигенетските модификации, клеточната пролиферација, диференцијацијата и програмираната клеточна смрт1. Особено, митохондријалниот метаболизам е клучен за развојот, преживувањето и функцијата на невроните и е широко вмешан во различни манифестации на невропатологијата2,3,4.
Во текот на изминатата деценија, метаболичкиот статус се појави како централен регулатор на неврогенезата, диференцијацијата, созревањето и пластичноста5,6. Неодамна, митохондријалната морфологија и динамика станаа особено важни компоненти на митозата, динамичен процес кој одржува базен на здрави митохондрии во клетките. Митохондријалната динамика е регулирана од сложени меѓузависни патишта кои се движат од митохондријална биогенеза и биоенергетика до митохондријална фисија, фузија, транспорт и клиренс7,8. Нарушувањето на кој било од овие интегративни механизми го нарушува одржувањето на здрави митохондријални мрежи и има длабоки функционални последици за невроразвојот9,10. Всушност, дисрегулацијата на митохондријалната динамика е забележана кај многу психијатриски, невродегенеративни и невроразвојни нарушувања, вклучувајќи ги и нарушувањата од аутистичниот спектар (АСД)11,12.
АСН е хетерогено невроразвојно нарушување со комплексна генетска и епигенетска архитектура. Наследноста на АСН е неоспорна, но основната молекуларна етиологија останува слабо разбрана. Акумулираните податоци од претклинички модели, клинички студии и мулти-омични молекуларни податочни групи даваат сè повеќе докази за митохондријална дисфункција кај АСН13,14. Претходно извршивме скрининг на метилација на ДНК на целиот геном кај кохорта пациенти со АСН и идентификувавме диференцијално метилирани гени групирани по должината на митохондријалните метаболички патишта15. Последователно објавивме диференцијална метилација на централните регулатори на митохондријалната биогенеза и динамика, што беше поврзано со зголемен број на копии на mtDNA и изменет уринарен метаболички профил кај АСН16. Нашите податоци даваат сè повеќе докази дека митохондријалната динамика и хомеостазата играат централна улога во патофизиологијата на АСН. Затоа, подобрувањето на механистичкото разбирање на врската помеѓу митохондријалната динамика, морфологија и функција е клучна цел на тековните истражувања за невролошки заболувања карактеризирани со секундарна митохондријална дисфункција.
Молекуларните техники често се користат за проучување на улогата на специфични гени во митохондријалните одговори на стрес. Сепак, овој пристап може да биде ограничен од повеќеслојната и временска природа на механизмите за митотична контрола. Покрај тоа, диференцијалната експресија на митохондријалните гени е индиректен индикатор за функционални промени, особено затоа што обично се анализираат само ограничен број гени. Затоа, предложени се подиректни методи за проучување на митохондријалната функција и биоенергетиката17. Митохондријалната морфологија е тесно поврзана со митохондријалната динамика. Митохондријалната форма, поврзаноста и структурата се критични за производството на енергија и преживувањето на митохондријата и клетките5,18. Покрај тоа, различните компоненти на митозата се фокусираат на промените во митохондријалната морфологија, кои можат да послужат како корисни крајни точки на митохондријалната дисфункција и да обезбедат основа за последователни механистички студии.
Митохондријалната морфологија може директно да се набљудува со помош на трансмисиона електронска микроскопија (TEM), овозможувајќи детално проучување на клеточната ултраструктура. TEM директно ја визуелизира морфологијата, обликот и структурата на митохондријалните кристи при резолуција на поединечните митохондрии, наместо да се потпира исклучиво на транскрипција на гени, експресија на протеини или митохондријални функционални параметри во клеточните популации17,19,20. Покрај тоа, TEM го олеснува проучувањето на интеракциите помеѓу митохондриите и другите органели, како што се ендоплазматскиот ретикулум и автофагозомите, кои играат клучна улога во митохондријалната функција и хомеостазата21,22. Така, ова го прави TEM добра почетна точка за проучување на митохондријалната дисфункција пред да се фокусира на специфични патишта или гени. Бидејќи митохондријалната функција станува сè порелевантна за невропатологијата, постои јасна потреба да се може директно и квантитативно да се проучува митохондријалната морфологија и динамика во in vitro невронски модели.
Во овој напис, ја испитуваме митохондријалната динамика во невронален модел на митохондријална дисфункција кај нарушувања од аутистичниот спектар. Претходно објавивме диференцијална метилација на пропионил-CoA карбоксилаза бета (PCCB) кај ASD15, подединица на митохондријалниот ензим PCC пропионил-CoA карбоксилаза. Познато е дека дисрегулацијата на PCC предизвикува токсична акумулација на пропионил деривати, вклучувајќи ја и пропионската киселина (PPA)23,24,25. Докажано е дека PPA го нарушува невронскиот метаболизам и го менува однесувањето in vivo и е воспоставен животински модел за проучување на невроразвојните механизми вклучени во ASD26,27,28. Дополнително, објавено е дека PPA го нарушува потенцијалот на митохондријалната мембрана, биогенезата и дишењето in vitro и е широко користен за моделирање на митохондријалната дисфункција кај невроните29,30. Сепак, влијанието на митохондријалната дисфункција предизвикана од PPA врз митохондријалната морфологија и динамика останува слабо разбрано.
Оваа студија користи комплементарни техники на снимање за да ги квантифицира ефектите на PPA врз митохондријалната морфологија, динамика и функција во SH-SY5Y клетките. Прво, развивме TEM метод за визуелизација на промените во митохондријалната морфологија и ултраструктура17,31,32. Со оглед на динамичната природа на митохондриите33, исто така користевме анализа на локализатор на митохондријални настани (MEL) за да ги квантифицираме промените во рамнотежата помеѓу настаните на фисија и фузија, бројот и волуменот на митохондријата под стрес од PPA. Конечно, испитавме дали митохондријалната морфологија и динамика се поврзани со промени во експресијата на гените вклучени во биогенезата, фисијата и фузијата. Земени заедно, нашите податоци го илустрираат предизвикот за разјаснување на сложеноста на механизмите што ја регулираат митохондријалната динамика. Ја истакнуваме корисноста на TEM во проучувањето на митохондријалната морфологија како мерлива конвергентна крајна точка на митозата во SH-SY5Y клетките. Дополнително, истакнуваме дека TEM податоците обезбедуваат најбогати информации кога се комбинираат со техники на снимање кои исто така ги доловуваат динамичките настани како одговор на метаболички стрес. Понатамошната карактеризација на молекуларните регулаторни механизми кои ја поддржуваат митозата на невронските клетки може да обезбеди важен увид во митохондријалната компонента на нервниот систем и невродегенеративните заболувања.
За да се предизвика митохондријален стрес, SH-SY5Y клетките беа третирани со PPA користејќи 3 mM и 5 mM натриум пропионат (NaP). Пред TEM, примероците беа подложени на криогена подготовка на примероците користејќи замрзнување и замрзнување под висок притисок (Сл. 1a). Развивме автоматизиран цевковод за анализа на митохондријална слика за мерење на осум морфолошки параметри на митохондријалните популации низ три биолошки реплики. Откривме дека третманот со PPA значително променил четири параметри: површина 2, површина, периметар и дијаметар на Feret (Сл. 1b-e). Површината 2 значително се намалила со третман со PPA од 3 mM и 5 mM (p = 0,0183 и p = 0,002, соодветно) (Сл. 1b), додека површината (p = 0,003), периметарот (p = 0,0106) и дијаметарот на Feret значително се намалиле. Имаше значително намалување (p = 0,0172) во групата за третман со 5 mM во споредба со контролната група (Сл. 1c-e). Значително намалување на површината и обемот покажаа дека клетките третирани со 5 mM PPA имале помали, позаоблени митохондрии и дека овие митохондрии биле помалку издолжени од оние во контролните клетки. Ова е исто така во согласност со значително намалување на дијаметарот на Ферет, независен параметар што укажува на намалување на најголемото растојание помеѓу рабовите на честичките. Забележани се промени во ултраструктурата на кристите: кристите станале помалку изразени под влијание на PPA стресот (Сл. 1а, панел Б). Сепак, не сите слики јасно ја одразуваат ултраструктурата на кристите, па затоа не е спроведена квантитативна анализа на овие промени. Овие TEM податоци може да одразуваат три можни сценарија: (1) PPA ја подобрува фисијата или ја инхибира фузијата, предизвикувајќи постојните митохондрии да се намалат во големина; (2) подобрената биогенеза создава нови, помали митохондрии или (3) ги индуцира двата механизми истовремено. Иако овие услови не можат да се разликуваат со TEM, значајните морфолошки промени укажуваат на промени во митохондријалната хомеостаза и динамика под PPA стрес. Последователно истраживме дополнителни параметри за дополнително да ги карактеризираме овие динамики и потенцијалните механизми што лежат во нивната основа.
Пропионската киселина (PPA) ја ремоделира митохондријалната морфологија. (a) Репрезентативни слики од трансмисиона електронска микроскопија (TEM) кои покажуваат дека големината на митохондријата се намалува, а митохондриите стануваат помали и позаоблени со зголемување на третманот со PPA; 0 mM (нетретирани), 3 mM и 5 mM, соодветно. Црвените стрелки означуваат митохондрии. (b–e) SH-SY5Y клетки третирани со PPA 24 часа беа подготвени за TEM и резултатите беа анализирани со помош на Fiji/ImageJ. Четири од осумте параметри покажаа значајни разлики помеѓу контролните (нетретирани, 0 mM PPA) и третираните (3 mM и 5 mM PPA) клетки. (b) Регион 2, (c) Површина, (d) Периметар, (e) Дијаметар на Ферет. Еднонасочна анализа на варијансата (контрола наспроти третман) и Данетов повеќекратен споредбен тест беа користени за да се утврдат значајни разлики (p < 0,05). Податочните точки ја претставуваат просечната митохондријална вредност за секоја поединечна клетка, а лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± SEM. Прикажаните податоци претставуваат n = 3, најмалку 24 клетки по реплика; Анализирани се вкупно 266 слики; * означува p < 0,05, ** означува p < 0,01.
За понатамошно карактеризирање на тоа како митохондријалната динамика реагира на PPA, ги обоивме митохондриите со тетраметилродамин етил естер (TMRE) и користевме временски зафатена микроскопија и MEL анализа за да ги локализираме и квантификуваме митохондриите по 24 часа на 3 и 5 mM PPA. Третман на настани на фисија и фузија. (Сл. 2а). По MEL анализата, митохондриите беа дополнително анализирани за да се квантифицира бројот на митохондријални структури и нивниот просечен волумен. Забележавме мало, но значајно зголемување на бројот на настани на фисија што се случија на 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] во споредба со настаните на фисија [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] и фузија [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] и фузија [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] беа значително зголемени на 5 mM во споредба со контролата (Сл. 3б). Бројот на митохондрии значително се зголеми и на 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] и на 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Сл. 3в), додека просечниот волумен на секоја митохондријална структура остана непроменет (Сл. 3в). 3д). Земено заедно, ова сугерира дека ремоделирањето на митохондријалната динамика служи како компензаторен одговор кој успешно го одржува интегритетот на митохондријалната мрежа. Зголемувањето на бројот на настани на фисија при 3 mM PPA сугерира дека зголемувањето на митохондријалниот број делумно се должи на митохондријалната фисија, но со оглед на тоа што просечниот митохондријален волумен останува во суштина непроменет, биогенезата не може да се исклучи како дополнителен компензаторен одговор. Сепак, овие податоци се во согласност со помалите, тркалезни митохондријални структури забележани со TEM, а исто така покажуваат значајни промени во митохондријалната динамика предизвикани од PPA.
Пропионската киселина (PPA) предизвикува динамичко митохондријално ремоделирање за да се одржи интегритетот на мрежата. SH-SY5Y клетките беа култивирани, третирани со 3 и 5 mM PPA во тек на 24 часа и обоени со TMRE и Hoechst 33342, проследено со MEL анализа. (a) Репрезентативни слики од временски зафатена микроскопија што прикажуваат проекции во боја и бинаризирани проекции со максимален интензитет во време 2 (t2) за секоја состојба. Избраните региони означени на секоја бинарна слика се подобрени и прикажани во 3D во три различни временски рамки (t1-t3) за да се илустрира динамиката со текот на времето; настаните на фузија се означени со зелена боја; настаните на фисија се означени со зелена боја. Прикажани со црвена боја. (b) Просечен број на динамички настани по состојба. (c) Просечен број на митохондријални структури по клетка. (d) Просечен волумен (µm3) на секоја митохондријална структура по клетка. Прикажаните податоци се репрезентативни за n = 15 клетки по група за третман. Прикажаните ленти за грешка претставуваат средна вредност ± SEM, скала = 10 μm, * p < 0,05.
Пропионската киселина (PPA) предизвикува транскрипциска супресија на гените поврзани со митохондријалната динамика. SH-SY5Y клетките беа третирани со 3 и 5 mM PPA во тек на 24 часа. Релативната квантификација на гените беше извршена со употреба на RT-qPCR и нормализирана на B2M. Гени за митохондријална биогенеза (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 и (d) NFE2L2. Гени за митохондријална фузија и фисија (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 и (i) DRP1. Значајни разлики (p < 0,05) беа тестирани со употреба на еднонасочна ANOVA (контрола наспроти третман) и Dunnett-ов тест за повеќекратна споредба: * означува p < 0,05, ** означува p < 0,01, а **** означува p < 0,0001. Лентите претставуваат средна експресија ± SEM. Прикажаните податоци претставуваат n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) и n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биолошки реплики.
Податоците од TEM и MEL анализите заедно укажуваат дека PPA ја менува митохондријалната морфологија и динамика. Сепак, овие техники на снимање не даваат увид во основните механизми што ги движат овие процеси. Затоа ја испитавме експресијата на mRNA на девет клучни регулатори на митохондријалната динамика, биогенезата и митозата како одговор на третманот со PPA. Го квантификувавме онкогенот на клеточниот миелом (cMYC), нуклеарниот респираторен фактор (NRF1), митохондријалниот транскрипциски фактор 1 (TFAM), транскрипцискиот фактор сличен на NFE2 BZIP (NFE2L2), гастрин-сличен протеин 2 (STOML2), атрофија на оптичкиот нерв 1 (OPA1), митофузин 1 (MFN1), митофузин 2 (MFN2) и динамин-поврзан протеин 1 (DRP1) по 24 часа третман со 3 mM и 5 mM PPA. Забележавме третман со PPA од 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 и p < 0,0001, соодветно) и 5 ​​mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Сл. 3a-c). Намалувањето на експресијата на mRNA беше зависно од дозата: експресијата на cMYC, NRF1 и TFAM се намали за 5,7, 2,6 и 1,9 пати на 3 mM, соодветно, и за 11,2, 3 и 2,2 пати на 5 mM. Спротивно на тоа, генот за централна редокс биогенеза NFE2L2 не беше променет при ниедна концентрација на PPA, иако беше забележан сличен тренд на намалена експресија зависен од дозата (Сл. 3d).
Исто така, ја испитавме експресијата на класичните гени вклучени во регулирањето на фисијата и фузијата. Се смета дека STOML2 е вклучен во фузијата, митофагијата и биогенезата, а неговата експресија беше значително намалена (p < 0,0001) за 3 mM (2,4-кратна промена) и 5 ​​mM (2,8-кратна промена) PPA (Сл. 1). 3d). Слично на тоа, експресијата на генот за фузија OPA1 беше намалена на 3 mM (1,6-кратна промена) и 5 ​​mM (1,9-кратна промена) PPA (p = 0,006 и p = 0,0024, соодветно) (Сл. 3f). Сепак, не најдовме значајни разлики во експресијата на гените за фузија MFN1, MFN2 или генот за фисија DRP1 под 24-часовен PPA стрес (Сл. 3g–i). Покрај тоа, откривме дека нивоата на четири протеини за фузија и фисија (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1) не се променија под истите услови (Сл. 4a-d). Важно е да се напомене дека овие податоци одразуваат еден момент во времето и можеби не одразуваат промени во експресијата на протеините или нивоата на активност за време на раните фази на стрес од PPA. Сепак, значителното намалување на експресијата на cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 укажува на значајна транскрипциска дисрегулација на митохондријалниот метаболизам, биогенезата и динамиката. Покрај тоа, овие податоци ја истакнуваат корисноста на техниките за снимање за директно проучување на промените во крајната состојба на митохондријалната функција.
Нивоата на протеините на факторот на фузија и фисија не се променија по третманот со пропионска киселина (PPA). SH-SY5Y клетките беа третирани со 3 и 5 mM PPA во тек на 24 часа. Нивоата на протеини беа квантифицирани со Western blot анализа, а нивоата на експресија беа нормализирани во однос на вкупните протеини. Прикажани се просечната експресија на протеини и репрезентативните Western blots на целните и вкупните протеини. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Лентите претставуваат средна вредност ± SEM, а прикажаните податоци се репрезентативни за n = 3 биолошки реплики. Повеќекратни споредби (p < 0,05) беа извршени со користење на еднонасочна анализа на варијансата и Dunnett-ов тест. Оригиналниот гел и blot се прикажани на Слика S1.
Митохондријалната дисфункција е поврзана со мултисистемски заболувања, почнувајќи од метаболички, кардиоваскуларни и мускулни заболувања, па сè до невролошки заболувања1,10. Многу невродегенеративни и невродегенеративни заболувања се поврзани со митохондријална дисфункција, што ја истакнува важноста на овие органели во текот на целиот животен век на мозокот. Овие болести вклучуваат Паркинсонова болест, Алцхајмерова болест и ASD3,4,18. Сепак, пристапот до мозочното ткиво за проучување на овие болести е тежок, особено на механистичко ниво, што ги прави системите на клеточни модели неопходна алтернатива. Во оваа студија, користиме систем на клеточни модели користејќи SH-SY5Y клетки третирани со PPA за да ја рекапитулираме митохондријалната дисфункција забележана кај невронските заболувања, особено нарушувањата од аутистичниот спектар. Користењето на овој PPA модел за проучување на митохондријалната динамика кај невроните може да даде увид во етиологијата на ASD.
Ја истраживме можноста за користење на TEM за да ги видиме промените во митохондријалната морфологија. Важно е да се напомене дека TEM мора да се користи правилно за да се максимизира неговата ефикасност. Подготовката на крио-примероци овозможува подобро зачувување на невронските структури со истовремено фиксирање на клеточните компоненти и намалување на формирањето на артефакти34. Во согласност со ова, забележавме дека клетките SH-SY5Y слични на неврони имале недопрени субцелуларни органели и издолжени митохондрии (Сл. 1а). Ова ја истакнува корисноста на техниките за криогена подготовка за проучување на митохондријалната морфологија во моделите на невронски клетки. Иако квантитативните мерења се критични за објективна анализа на TEM податоците, сè уште нема консензус за тоа кои специфични параметри треба да се мерат за да се потврдат митохондријалните морфолошки промени. Врз основа на голем број студии кои квантитативно ја испитале митохондријалната морфологија17,31,32, развивме автоматизиран цевковод за анализа на митохондријална слика кој мери осум морфолошки параметри, имено: површина, површина2, сооднос на ширина и висина, периметар, кружност, степен , Феретов дијаметар и заобленост.
Меѓу нив, PPA значително ја намали површината 2, површината, периметарот и дијаметарот на Ферет (Сл. 1б-е). Ова покажа дека митохондриите станале помали и позаоблени, што е во согласност со претходните студии кои покажуваат намалување на митохондријалната површина по 72 часа митохондријален стрес предизвикан од PPA30. Овие морфолошки карактеристики може да укажуваат на митохондријална фисија, неопходен процес за одвојување на оштетените компоненти од митохондријалната мрежа за да се промовира нивната деградација преку митофагија35,36,37. Од друга страна, намалувањето на просечната големина на митохондријата може да биде поврзано со зголемена биогенеза, што резултира со формирање на мали митохондрии во почетна фаза. Зголемената фисија или биогенеза претставува компензаторски одговор за одржување на митозата против митохондријалниот стрес. Сепак, намалениот митохондријален раст, нарушената фузија или други состојби не можат да се исклучат.
Иако сликите со висока резолуција создадени со TEM овозможуваат одредување на морфолошките карактеристики на ниво на поединечни митохондрии, овој метод произведува дводимензионални снимки во еден момент. За да ги проучиме динамичките одговори на метаболички стрес, ги обоивме митохондриите со TMRE и користевме временски зафатна микроскопија со MEL анализа, што овозможува високопропусна 3D визуелизација на промените во митохондријалната мрежа со текот на времето33,38. Забележавме суптилни, но значајни промени во митохондријалната динамика под стрес од PPA (Сл. 2). На 3 mM, бројот на настани на фисија значително се зголеми, додека настаните на фузија останаа исти како и во контролната група. Зголемување на бројот и на настани на фисија и на настани на фузија беше забележано на 5 mM PPA, но овие промени беа приближно пропорционални, што сугерира дека кинетиката на фисија и фузија достигнува рамнотежа при повисоки концентрации (Сл. 2б). Просечниот митохондријален волумен остана непроменет и на 3 и на 5 mM PPA, што укажува дека интегритетот на митохондријалната мрежа е зачуван (Сл. 2д). Ова ја одразува способноста на динамичните митохондријални мрежи да реагираат на благ метаболички стрес за ефикасно одржување на хомеостазата без да предизвикаат фрагментација на мрежата. При 3 mM PPA, зголемувањето на фисијата е доволно за да се промовира транзиција кон нова рамнотежа, но потребно е подлабоко кинетичко ремоделирање како одговор на стресот предизвикан од повисоки концентрации на PPA.
Бројот на митохондрии се зголеми при обете концентрации на стрес од PPA, но просечниот митохондријален волумен не се промени значително (Сл. 2в). Ова може да се должи на зголемена биогенеза или зголемена поделба; сепак, во отсуство на значително намалување на просечниот митохондријален волумен, поверојатно е дека биосинтезата се зголемува. Сепак, податоците на Слика 2 го поддржуваат постоењето на два компензаторни механизми: зголемување на бројот на настани на фисија, во согласност со зголемената регулација на митохондријалната фисија, и зголемување на бројот на настани, во согласност со митохондријалната биогенеза. На крајот на краиштата, динамичката компензација за благ стрес може да се состои од истовремени процеси што вклучуваат фисија, фузија, биогенеза и митофагија. Иако претходните автори покажаа дека PPA ја подобрува митозата30,39 и митофагијата29, ние даваме докази за ремоделирање на митохондријалната фисија и динамиката на фузија како одговор на PPA. Овие податоци ги потврдуваат морфолошките промени забележани со TEM и даваат понатамошен увид во механизмите поврзани со митохондријалната дисфункција предизвикана од PPA.
Бидејќи ниту TEM ниту MEL анализата не дадоа директен доказ за механизмите за регулација на гените што лежат во основата на набљудуваните морфолошки промени, ја испитавме РНК експресијата на гените вклучени во митохондријалниот метаболизам, биогенезата и динамиката. Прото-онкогенот cMYC е транскрипциски фактор вклучен во регулирањето на митохондриите, гликолизата, метаболизмот на аминокиселините и масните киселини40. Покрај тоа, познато е дека cMYC ја регулира експресијата на речиси 600 митохондријални гени вклучени во митохондријалната транскрипција, транслацијата и склопувањето на комплекси, вклучувајќи ги NRF1 и TFAM41. NRF1 и TFAM се два централни регулатори на митозата, дејствувајќи низводно од PGC-1α за да ја активираат репликацијата на mtDNA. Оваа патека се активира со cAMP и AMPK сигнализација и е чувствителна на потрошувачка на енергија и метаболички стрес. Исто така, испитавме NFE2L2, редокс регулатор на митохондријалната биогенеза, за да утврдиме дали ефектите на PPA може да бидат посредувани од оксидативен стрес.
Иако експресијата на NFE2L2 остана непроменета, откривме конзистентно дозно-зависно намалување на експресијата на cMYC, NRF1 и TFAM по 24 часа третман со 3 mM и 5 mM PPA (Сл. 3a-c). Намалувањето на експресијата на cMYC претходно е пријавено како одговор на митохондријален стрес42, и обратно, намалувањето на експресијата на cMYC може да предизвика митохондријална дисфункција со ремоделирање на митохондријалниот метаболизам, мрежната поврзаност и мембранската поларизација43. Интересно е што cMYC е исто така вклучен во регулирањето на митохондријалната фисија и фузија42,43 и е познато дека ја зголемува фосфорилацијата на DRP1 и митохондријалната локализација за време на клеточната делба44, како и посредува во митохондријалното морфолошко ремоделирање во невронските матични клетки45. Всушност, фибробластите со недостаток на cMYC покажуваат намалена митохондријална големина, што е во согласност со промените предизвикани од стресот на PPA43. Овие податоци илустрираат интересна, но сè уште нејасна врска помеѓу cMYC и митохондријалната динамика, обезбедувајќи интересна цел за идните студии за ремоделирање предизвикано од стрес на PPA.
Намалувањето на NRF1 и TFAM е во согласност со улогата на cMYC како важен транскрипциски активатор. Овие податоци се исто така во согласност со претходните студии на клетки на рак на дебело црево кај луѓето кои покажуваат дека PPA ја намалила експресијата на NRF1 mRNA по 22 часа, што било поврзано со намалување на ATP и зголемен ROS46. Овие автори, исто така, објавиле дека експресијата на TFAM се зголемила по 8,5 часа, но се вратила на основните нивоа по 22 часа. Спротивно на тоа, Kim et al. (2019) покажале дека експресијата на TFAM mRNA била значително намалена по 4 часа стрес од PPA во клетките SH-SY5Y; сепак, по 72 часа, експресијата на TFAM протеинот била значително зголемена, а бројот на копии на mtDNA бил значително зголемен. Така, намалувањето на бројот на гени за митохондријална биогенеза што го забележавме по 24 часа не ја исклучува можноста дека зголемувањето на бројот на митохондрии е поврзано со активирање на биогенезата во претходни временски точки. Претходни студии покажаа дека PPA значително ја зголемува PGC-1α mRNA и протеинот во SH-SY5Y клетките на 4 часа и 30 минути, додека пропионската киселина ја подобрува митохондријалната биогенеза во хепатоцитите на телето преку PGC-1α на 12 часа и 39 минути. Интересно е што PGC-1α не е само директен транскрипциски регулатор на NRF1 и TFAM, туку е покажано и дека ја регулира активноста на MFN2 и DRP1 со регулирање на фисијата и фузијата47. Земени заедно, ова го истакнува тесното поврзување на механизмите што ги регулираат митохондријалните компензаторни одговори предизвикани од PPA. Покрај тоа, нашите податоци одразуваат значајна дисрегулација на транскрипциската регулација на биогенезата и метаболизмот под стрес од PPA.
Гените STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1 се меѓу централните регулатори на митохондријалната фисија, фузија и динамика37,48,49. Постојат многу други гени вклучени во митохондријалната динамика, меѓутоа, претходно е откриено дека STOML2, OPA1 и MFN2 се диференцијално метилирани кај ASD кохорти,16 и неколку независни студии објавија промени во овие транскрипциски фактори како одговор на митохондријалниот стрес50,51. 52. Експресијата и на OPA1 и на STOML2 беше значително намалена со третман со 3 mM и 5 mM PPA (Сл. 3e, f). OPA1 е еден од класичните регулатори на митохондријалната фузија преку директна интеракција со MFN1 и 2 и игра улога во ремоделирањето на кристите и митохондријалната морфологија53. Прецизната улога на STOML2 во митохондријалната динамика останува нејасна, но доказите сугерираат дека игра улога во митохондријалната фузија, биогенезата и митофагијата.
STOML2 е вклучен во одржувањето на митохондријалното респираторно поврзување и формирањето на комплекси на респираторниот синџир54,55 и е докажано дека длабоко ги менува метаболичките карактеристики на клетките на ракот56. Студиите покажаа дека STOML2 го промовира потенцијалот на митохондријалната мембрана и биогенезата преку интеракција со BAN и кардиолипин 55, 57, 58. Дополнително, независни студии покажаа дека интеракцијата помеѓу STOML2 и PINK1 ја регулира митофагијата59,60. Имено, објавено е дека STOML2 директно комуницира со и го стабилизира MFN2, а исто така игра важна улога во стабилизирањето на долгите OPA1 изоформи со инхибирање на протеазата одговорна за деградација на OPA153,61,62. Намалувањето на експресијата на STOML2 забележано во PPA реакциите може да ги направи овие фузиони протеини поподложни на деградација преку патишта зависни од убиквитин и протеазом48. Иако прецизната улога на STOML2 и OPA1 во динамичкиот одговор на PPA е нејасна, намалената експресија на овие фузиони гени (Слика 3) може да ја наруши рамнотежата помеѓу фисијата и фузијата и да доведе до намалена големина на митохондријата (Слика 3). 1).
Од друга страна, експресијата на протеинот OPA1 остана непроменета по 24 часа, додека нивоата на mRNA и протеини на MFN1, MFN2 или DRP1 не се променија значително по третманот со PPA (сл. 3g-i, сл. 4). Ова може да укажува дека нема промени во регулацијата на овие фактори вклучени во митохондријалната фузија и фисија. Сепак, вреди да се напомене дека секој од овие четири гени е регулиран и со посттранскрипциски модификации (PTMs) кои ја контролираат активноста на протеините. OPA1 има осум алтернативни варијанти на сплајс кои се протеолитички расцепуваат во митохондриите за да произведат две различни изоформи 63. Рамнотежата помеѓу долгите и кратките изоформи на крајот ја одредува улогата на OPA1 во митохондријалната фузија и одржувањето на митохондријалната мрежа 64. Активноста на DRP1 е регулирана со фосфорилација на протеин киназа II зависна од калциум/калмодулин (CaMKII), додека деградацијата на DRP1 е регулирана со убиквитинација и SUMOилација 65. Конечно, и DRP1 и MFN1/2 се GTPази, па затоа активноста може да биде под влијание на стапката на производство на GTP во митохондриите 66. Затоа, иако експресијата на овие протеини останува константна, ова може да не ја одразува непроменетата активност или локализација на протеините 67,68. Всушност, постојните репертоари на PTM протеини често служат како прва линија на одбрана одговорна за посредување на акутни реакции на стрес. Во присуство на умерен метаболички стрес во нашиот модел, веројатно е дека PTM промовира зголемена активност на фузиони и фисиони протеини за доволно враќање на митохондријалниот интегритет без да се бара дополнително активирање на овие гени на ниво на mRNA или протеин.
Земени заедно, горенаведените податоци ја истакнуваат сложената и временски зависна регулација на митохондријалната морфологија и предизвиците за разјаснување на овие механизми. За да се проучи генската експресија, прво е потребно да се идентификуваат специфични целни гени во патеката. Сепак, нашите податоци покажуваат дека гените во истата патека не реагираат на ист начин на истиот стрес. Всушност, претходните студии покажаа дека различни гени во истата патека може да покажат различни профили на временски одговор30,46. Покрај тоа, постојат сложени пост-транскрипциски механизми кои ја нарушуваат врската помеѓу транскрипцијата и функцијата на гените. Протеомските студии можат да дадат увид во влијанието на PTM и функцијата на протеините, но тие исто така претставуваат предизвици, вклучувајќи методи со низок проток, висок однос сигнал-шум и слаба резолуција.
Во овој контекст, проучувањето на митохондријалната морфологија со користење на TEM и MEL има голем потенцијал за решавање на фундаментални прашања за односот помеѓу митохондријалната динамика и функција и како тоа влијае на болеста. Најважно од сè, TEM обезбедува директен метод за мерење на митохондријалната морфологија како конвергентна крајна точка на митохондријална дисфункција и динамика51. MEL, исто така, обезбедува директен метод за визуелизација на настани на фисија и фузија во тридимензионална клеточна средина, овозможувајќи квантификација на динамичкото митохондријално ремоделирање дури и во отсуство на промени во генската експресија33. Овде ја истакнуваме корисноста на техниките на митохондријално снимање кај секундарните митохондријални заболувања. Овие болести обично се карактеризираат со хроничен благ метаболички стрес карактеризиран со суптилно ремоделирање на митохондријалните мрежи, а не со акутно митохондријално оштетување. Сепак, митохондријалната компензација потребна за одржување на митозата под хроничен стрес има длабоки функционални последици. Во контекст на невронауката, подоброто разбирање на овие компензаторни механизми може да обезбеди важни информации за плејотропната невропатологија поврзана со митохондријалната дисфункција.
На крајот на краиштата, нашите податоци ја истакнуваат корисноста на техниките за снимање за разбирање на функционалните последици од сложените интеракции помеѓу генската експресија, модификациите на протеините и активноста на протеините што ја контролираат невронската митохондријална динамика. Користевме PPA за моделирање на митохондријалната дисфункција во модел на невронски клетки за да добиеме увид во митохондријалната компонента на ASD. SH-SY5Y клетките третирани со PPA покажаа промени во митохондријалната морфологија: митохондриите станаа мали и тркалезни, а кристите беа слабо дефинирани кога се набљудуваа со TEM. MEL анализата покажува дека овие промени се случуваат истовремено со зголемување на настаните на фисија и фузија за да се одржи митохондријалната мрежа како одговор на благ метаболички стрес. Покрај тоа, PPA значително ја нарушува транскрипциската регулација на митохондријалниот метаболизам и хомеостазата. Ги идентификувавме cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 како клучни митохондријални регулатори нарушени од стресот на PPA и може да играат улога во посредувањето на промените во митохондријалната морфологија и функција предизвикани од PPA. Потребни се идни студии за подобро карактеризирање на временските промени во генската експресија и активноста на протеините, локализацијата и пост-транслационите модификации предизвикани од PPA. Нашите податоци ја истакнуваат сложеноста и меѓузависноста на регулаторните механизми што посредуваат во одговорот на митохондријалниот стрес и ја демонстрираат корисноста на TEM и другите техники на снимање за поцелни механистички студии.
Клеточната линија SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) беше купена од Sigma-Aldrich. SH-SY5Y клетките беа одгледувани во модифициран Dulbecco's Eagle's medium/F-12 хранлива смеса (DMEM/F-12) и L-глутамин (SC09411, ScienCell) во колби од 25 cm2 дополнети со 20% фетален говедски серум (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) и 1% пеницилин-стрептомицин (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) на 37 °C, 5% CO2. Клетките беа субкултивирани до 80% конфлуенција користејќи 0,05% трипсин-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), центрифугирани на 300 g и залепени со густина од приближно 7 × 105 клетки/ml. Сите експерименти беа извршени на недиференцирани SH-SY5Y клетки помеѓу пасажите 19–22. PPA се администрира како NaP. Растворете го NaP правот (CAS бр. 137-40-6, хемиска формула C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) во топла MilliQ вода до концентрација од 1 M и чувајте на 4 °C. На денот на третманот, разредете го овој раствор со 1 M PPA до 3 mM и 5 mM PPA во медиум без серум (DMEM/F-12 со L-глутамин). Концентрациите на третманот за сите експерименти беа без PPA (0 mM, контрола), 3 mM и 5 mM PPA. Експериментите беа спроведени во најмалку три биолошки повторувања.
SH-SY5Y клетките беа засеани во колби од 25 cm5 со брзина од 5,5 × 105 клетки/ml и одгледувани 24 часа. Третманот со PPA беше додаден во колбата пред 24 часа инкубација. Соберете ги клеточните гранули следејќи ги нормалните протоколи за субкултура на ткиво кај цицачи (опишани погоре). Ресуспендирајте го клеточниот гранулат во 100 µl 2,5% глутаралдехид, 1× PBS и чувајте го на 4 °C до обработка. SH-SY5Y клетките беа кратко центрифугирани за да се пелетираат клетките и да се отстрани 2,5% глутаралдехид, 1× PBS раствор. Ресуспендирајте го седиментот во 4% агарозен гел подготвен во дестилирана вода (односот на агарозата кон волуменот на седиментот е 1:1). Парчињата агароза беа поставени на мрежи на рамни плочи и обложени со 1-хексадецен пред замрзнување под висок притисок. Примероците беа замрзнати во 100% сув ацетон на -90°C во тек на 24 часа. Потоа температурата беше покачена на -80°C и беше додаден раствор од 1% осмиум тетроксид и 0,1% глутаралдехид. Примероците беа чувани на -80°C 24 часа. После тоа, температурата постепено се зголемуваше до собна температура во текот на неколку дена: од -80°C до -50°C 24 часа, до -30°C 24 часа, до -10°C 24 часа и конечно до собна температура.
По криогената подготовка, примероците беа импрегнирани со смола и беа направени ултратенки пресеци (∼100 nm) со помош на ултрамикротом Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Пресеците беа обоени со 2% уранил ацетат и оловен цитрат. Примероците беа набљудувани со помош на трансмисионен електронски микроскоп FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (порано FEI), Ајндховен, Холандија) кој работеше на 200 kV (трансмитер Lab6) и камера Gatan CCD (Gatan, Велика Британија) опремена со енергетски филтер Tridiem.
Во секоја техничка репликација, беа добиени најмалку 24 слики од единечни клетки, за вкупно 266 слики. Сите слики беа анализирани со помош на макрото Регион од интерес (ROI) и макрото Митохондрија. Митохондријалното макро е базирано на објавени методи17,31,32 и овозможува полуавтоматизирана сериска обработка на TEM слики во Фиџи/ImageJ69. Накратко: сликата е инвертирана и инвертирана со помош на одземање на позадината од тркалачка топка (радиус од 60 пиксели) и FFT филтер за пропусен опсег (користејќи горни и долни граници од 60 и 8 пиксели, соодветно) и супресија на вертикалните линии со толеранција на ориентација од 5%. Обработената слика автоматски се одредува со праг со помош на алгоритам за максимална ентропија и се генерира бинарна маска. Регионите на сликата поврзани со рачно избрани ROI во сурови TEM слики беа извлечени, карактеризирајќи ги митохондриите и исклучувајќи ја плазматската мембрана и другите региони со висок контраст. За секој извлечен ROI, беа анализирани бинарни честички поголеми од 600 пиксели, а површината на честичките, периметарот, главните и споредните оски, дијаметарот на Ферет, заобленоста и кружноста беа измерени со помош на вградените функции за мерење на Fiji/ImageJ. Според Merrill, Flippo и Strack (2017), површината 2, соодносот на ширина и висина на честичките (однос на главната и споредната оска) и факторот на облик (FF) беа пресметани од овие податоци, каде што FF = периметар 2/4pi x површина. Дефиницијата на параметарската формула може да се најде во Merrill, Flippo и Strack (2017). Споменатите макроа се достапни на GitHub (видете ја Изјавата за достапност на податоци). Во просек, приближно 5.600 честички беа анализирани по PPA третман, за вкупно приближно 17.000 честички (податоците не се прикажани).
SH-SH5Y клетките беа поставени во 8-коморни садови за култура (ThermoFisher, #155411) за да се овозможи адхезија преку ноќ, а потоа инкубирани со TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) и Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Боење. Сликите беа добиени со помош на ласери од 405 nm и 561 nm во текот на 10 минути, а суровите слики беа добиени како z-стекови што содржат 10 микрографии со az чекор од 0,2 μm помеѓу сликите во 12 последователни временски точки. Сликите беа собрани со помош на платформа со супер резолуција Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Германија) со помош на објектив LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Сликите беа анализирани во ImageJ користејќи претходно опишан цевковод и додатокот ImageJ за мерење на настани на фузија и фисија, просечен број на митохондријални структури и просечен митохондријален волумен по клетка33. MEL макроа се достапни на GitHub (видете ја Изјавата за достапност на податоци).
SH-SY5Y клетките беа одгледувани во плочи со шест бунари со густина од 0,3 × 106 клетки/мл 24 часа пред третманот. РНК беше екстрахирана со користење на протоколот Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) со мали модификации: додадете 300 μl РНК лизативен пуфер во секоја бунар пред отстранување и лизирајте го секој примерок како последен чекор со 30 μl елуција на DNase/RNase. вода без DNase. Сите примероци беа проверени за количина и квалитет со користење на NanoDrop ND-1000 UV-Vis спектрофотометар. Вкупниот протеин од клеточните лизати беше добиен со користење на 200 μl RIPA лизатен пуфер, а концентрацијата на протеини беше квантифицирана со користење на тестот за протеини Bradford70.
Синтезата на кДНК беше извршена со помош на комплетот за синтеза на кДНК Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) според упатствата на производителот со некои модификации. кДНК беше синтетизирана во реакции од 20 μl со користење на 0,7 до 1 μg вкупна РНК. Прајмерите беа избрани од претходно објавени трудови 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Табела S1), а придружните сонди беа дизајнирани со помош на алатката PrimerQuest од Integrated DNA Technologies. Сите гени од интерес беа нормализирани на нуклеарниот ген B2M. Генската експресија на STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC и OPA1 беше измерена со RT-qPCR. Мастер миксот вклучуваше LUNA Taq полимераза (M3003L, New England Biolabs), 10 μM прајмери ​​за напред и назад, cDNA и вода од PCR-квалитет за да се добие конечен волумен од 10 μL за секоја реакција. Експресијата на гените за делба и фисија (DRP1, MFN1/2) беше измерена со помош на TaqMan мултиплекс тестови. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) беше користен според упатствата на производителот со мали модификации. Мултиплекс RT-qPCR мастер миксот вклучува 1X LUNA Taq полимераза, 10 μM прајмери ​​за напред и назад, 10 μM сонда, cDNA и вода од PCR-квалитет, што резултираше со конечен волумен од 20 μL за секоја реакција. RT-qPCR беше извршен со помош на Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - сериски број: R0618110). Условите за циклусирање се прикажани во Табела S1. Сите примероци од кДНК беа амплифицирани во три примероци и беше генерирана стандардна крива со користење на серија од десеткратни разредувања. Отстапувањата во три примероци со стандардна девијација на прагот на циклусот (Ct) >0,5 беа отстранети од анализата за да се обезбеди репродуктивност на податоците30,72. Релативната генска експресија беше пресметана со користење на методот 2-ΔΔCt79.
Протеинските примероци (60 μg) беа измешани со Laemmli пуфер за полнење во сооднос 2:1 и беа обработени на 12% безбоен протеински гел (Bio-Rad #1610184). Протеините беа префрлени на PVDF (поливинилиден флуорид) мембрана (#170-84156, Bio-Rad) со помош на Trans-Blot Turbo системот (#170-4155, Bio-Rad). Мембраната беше блокирана и инкубирана со соодветните примарни антитела (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1) (разредени 1:1000) 48 часа, по што следеше инкубација со секундарни антитела (1:10.000) 1 час. Потоа мембраните беа сликани со помош на Clarity Western ECL супстрат (#170-5061, Bio-Rad) и снимени со помош на Bio-Rad ChemiDoc MP систем. ImageLab верзија 6.1 беше користена за Western blot анализа. Оригиналниот гел и блот се прикажани на Слика S1. Информациите за антителата се дадени во Табела S2.
Збирките податоци се претставени како средна вредност и стандардна грешка на средната вредност (SEM) од најмалку три независни примероци. Збирките податоци беа тестирани за нормалност со помош на тестот Шапиро-Вилкс (освен ако не е поинаку наведено) пред да се претпостави Гаусова распределба и еднакви стандардни отстапувања и да се продолжи со анализите. Покрај анализата на збирот податоци со помош на Fisher's MEL LSD (p < 0,05), еднонасочна ANOVA (средна вредност на третманот наспроти контролата) и Dunnett's повеќекратен споредбен тест за да се утврди значајноста (p < 0,05). Значајните p вредности се прикажани на графиконот како *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Сите статистички анализи и графикони беа извршени и генерирани со помош на GraphPad Prism 9.4.0.
Макроа Fiji/ImageJ за анализа на TEM слики се јавно достапни на GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Макрото Mitochondrial Event Locator (MEL) е јавно достапно на GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Меилијана А., Деви НМ и Виџаја А. Митохондрии: главни регулатори на метаболизмот, хомеостазата, стресот, стареењето и епигенетиката. Индонезиски. Биомедицинска наука. J. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Мултифацетирана митохондријална дисфункција кај шизофренија, комплекс I како можна патолошка цел. Шизофренија. ресурс. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. и Бил, МФ Митохондријална дисфункција кај Паркинсонова болест. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Шарма ВК, Синг ТГ и Мехта В. Стресни митохондрии: цели на инвазија кај Алцхајмерова болест. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Беленгер П., Дуарте ЈМН, Шук ПФ и Фереира ГК Митохондриите и мозокот: биоенергетика и друго. Невротоксини. ресурс. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Плејотропни митохондрии: влијанието на митохондриите врз развојот на невроните и болестите. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Кардањо-Рамос, К. и Мораис, В.А. Митохондријална биогенеза кај невроните: како и каде. интернационалност. Ј. Мор. науката. 22, 13059 (2021).
Ју, Р., Лендал, У., Нистер, М. и Жао, Ј. Регулирање на митохондријалната динамика кај цицачите: можности и предизвици. front. endocrine. (Лозана) 11, 374 (2020).
Хачо, М. и Слек, РС Митохондријална динамика во регулирањето на неврогенезата: од мозокот во развој до мозокот во возрасен. развој. динамика. 247, 47–53 (2018).