Сегашност *Тековна адреса: Келн 50931, Германија, Кластер за извонредност во Келн, истражување за клеточен одговор на стрес кај болести поврзани со стареење (CECAD).
Невродегенерацијата на митохондријалните заболувања се смета за неповратна бидејќи метаболичката пластичност на невроните е ограничена, но ефектот на митохондријалната дисфункција врз автономијата на невронскиот метаболизам на клетките во телото е слабо разбран. Овде, го претставуваме специфичниот протеом на Пуркиниевите неврони со прогресивен недостаток на OXPHOS предизвикан од нарушена динамика на митохондријална фузија. Откривме дека митохондријалната дисфункција предизвика длабока промена во областа на протеомиката, што на крајот доведе до секвенцијално активирање на прецизни метаболички програми пред клеточната смрт. Неочекувано, ја утврдивме очигледната индукција на пируват карбоксилаза (PCx) и други ензими против стареење кои ги дополнуваат меѓупроизводите на TCA циклусот. Инхибицијата на PCx го влоши оксидативниот стрес и невродегенерацијата, што укажува дека атеросклерозата има заштитен ефект кај невроните на кои им недостасува OXPHOS. Реставрацијата на митохондријалната фузија кај терминално дегенерираните неврони целосно ги менува овие метаболички карактеристики, со што се спречува клеточната смрт. Нашите наоди идентификуваат претходно непознати патишта кои даваат отпорност на митохондријалната дисфункција и покажуваат дека невродегенерацијата може да се промени дури и во доцните фази на болеста.
Централната улога на митохондриите во одржувањето на метаболизмот на невронската енергија е нагласена од обемните невролошки симптоми поврзани со човечките митохондријални заболувања. Повеќето од овие болести се предизвикани од генски мутации кои ја регулираат митохондријалната генска експресија (1, 2) или уништување на гени поврзани со митохондријалната динамика, што индиректно влијае на стабилноста на митохондријалната ДНК (mtDNA) (3, 4). Работата на животински модели покажа дека како одговор на митохондријалната дисфункција во околните ткива, може да се активираат конзервативни метаболички патишта (5-7), што обезбедува важни информации за длабинско разбирање на патогенезата на овие сложени болести. Во остра спротивност, нашето разбирање на метаболичките промени на специфични типови клетки предизвикани од општата инсуфициенција на производството на аденозин трифосфат (ATP) во митохондријата на мозокот е фундаментално (8), нагласувајќи ја потребата од идентификување на терапевтски цели кои можат да се користат за спречување или спречување на болести. Спречување на невродегенерација (9). Недостатокот на информации е фактот дека нервните клетки се сметаат за многу ограничена метаболичка флексибилност во споредба со типовите клетки на околните ткива (10). Со оглед на тоа што овие клетки играат централна улога во координирањето на снабдувањето со метаболити до невроните за да се промовира синаптичката трансмисија и да се реагира на повреди и болести, способноста за прилагодување на клеточниот метаболизам на предизвикувачките услови на мозочното ткиво е речиси ограничена на глијалните клетки (11-14). Покрај тоа, вродената клеточна хетерогеност на мозочното ткиво во голема мера го попречува проучувањето на метаболичките промени што се јавуваат кај специфични невронски подгрупи. Како резултат на тоа, малку се знае за точните клеточни и метаболички последици од митохондријалната дисфункција кај невроните.
За да ги разбереме метаболичките последици од митохондријалната дисфункција, ги изолиравме Пуркиниевите неврони (ПН) во различни фази на невродегенерација предизвикана од уништување на фузијата на митохондријалната надворешна мембрана (Mfn2). Иако мутациите на Mfn2 кај луѓето се поврзани со форма на наследна моторна сензорна невропатија позната како Шарко-Мари-Тут тип 2А (15), условното уништување на Mfn2 кај глувците е добро познат метод на индукција на оксидациска фосфорилација (OXPHOS). Различните невронски подтипови (16-19) и резултирачкиот невродегенеративен фенотип се придружени со прогресивни невролошки симптоми, како што се нарушувања на движењето (18, 19) или церебеларна атаксија (16). Со користење на комбинација од квантитативна (LFQ) протеомика без ознака, метаболомика, снимање и вирусолошки методи, покажуваме дека прогресивната невродегенерација силно индуцира пируват карбоксилаза (PCx) и други фактори вклучени во артериосклерозата на ПН in vivo. Експресијата на ензими. За да ја потврдиме релевантноста на ова откритие, ние конкретно ја намаливме експресијата на PCx кај ПН со дефицит на Mfn2 и откривме дека оваа операција го влошува оксидативниот стрес и ја забрзува невродегенерацијата, со што се докажува дека азооспермијата дава клеточна смрт. Метаболна прилагодливост. Тешката експресија на MFN2 може целосно да ја спаси терминалната дегенерација на ПН со тежок недостаток на OXPHOS, масивна потрошувачка на митохондријална ДНК и очигледно нарушена митохондријална мрежа, што дополнително нагласува дека оваа форма на невродегенерација може дури и да се опорави во напредната фаза на болеста пред клеточната смрт.
За да ги визуелизираме митохондриите кај Mfn2 нокаутираните PN, користевме сој од глушец кој им овозможува на Cre-зависните митохондрии да ја таргетираат експресијата на Cre на жолтиот флуоресцентен протеин (YFP) (mtYFP) (20) и ја проверивме митохондријалната морфологија in vivo. Откривме дека уништувањето на генот Mfn2 кај PN ќе доведе до постепена поделба на митохондријалната мрежа (Слика S1A), а најраната промена е пронајдена на 3 недели возраст. Спротивно на тоа, значителната дегенерација на слојот на PN клетките, како што е потврдено со губењето на имунобоењето со Калбиндин, не започнала сè до 12 недели возраст (Слика 1, А и Б). Временската несовпаѓање помеѓу најраните промени во митохондријалната морфологија и видливиот почеток на невронската смрт нè поттикна да ги истражиме метаболичките промени предизвикани од митохондријалната дисфункција пред клеточната смрт. Развивме стратегија базирана на флуоресцентно активирано сортирање на клетки (FACS) за изолирање на PN кои експресираат YFP (YFP+) (Слика 1C), и кај контролни глувци (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), во понатамошниот текст CTRL (Слика S1B). Оптимизацијата на стратегијата за затворање врз основа на релативниот интензитет на YFP сигналот ни овозможува да го прочистиме YFP+ телото (YFPhigh) од PN од не-PN (YFPneg) (Слика S1B) или претпоставени флуоресцентни аксонски/дендритични фрагменти (YFPlow; Слика S1D, лево), потврдени со конфокален микроскоп (Слика S1D, десно). За да го потврдиме идентитетот на класифицираната популација, спроведовме LFQ протеомика, а потоа и анализа на главните компоненти и откривме дека постои јасна поделба помеѓу клетките YFPhigh и YFPneg (Слика S1C). YFPhigh клетките покажаа нето збогатување на познати PNs маркери (т.е. Calb1, Pcp2, Grid2 и Itpr3) (21, 22), но не и збогатување на протеини кои најчесто се експресираат во неврони или други типови клетки (Слика 1D). Споредбата помеѓу примероците во класифицирани YFPhigh клетки собрани во независни експерименти покажа коефициент на корелација > 0,9, демонстрирајќи добра репродуктивност помеѓу биолошките реплики (Слика S1E). Накратко, овие податоци го потврдија нашиот план за акутна и специфична изолација на изводлива PN. Бидејќи користениот систем за двигатели L7-cre индуцира мозаична рекомбинација во првата недела по породувањето (23), почнавме да ги отстрануваме глувците од CTRL и условните (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) неврони. Откако ќе заврши рекомбинацијата, таа се нарекува Mfn2cKO на 4 недели возраст. Како крајна точка, избравме возраст од 8 недели кога PN слојот беше недопрен и покрај очигледната митохондријална фрагментација (Слика 1Б и Слика S1A). Вкупно, квантификувавме вкупно 3013 протеини, од кои околу 22% беа базирани на MitoCarta 2.0 анотации базирани на митохондријалниот протеом како митохондрии (Слика 1Е) (Слика 1Е) (24). Анализата на диференцијалната генска експресија извршена во 8-та недела покажа дека само 10,5% од сите протеини имале значајни промени (Слика 1F и Слика S1F), од кои 195 протеини беа намалени, а 120 протеини беа зголемени (Слика 1F). Вреди да се напомене дека „анализата на иновативните патеки“ на овој збир на податоци покажува дека диференцијално експресираните гени главно припаѓаат на ограничен сет на специфични метаболички патишта (Слика 1G). Интересно е што, иако намалувањето на патиштата поврзани со OXPHOS и калциумовата сигнализација ја потврдува индукцијата на митохондријална дисфункција кај PN со дефицит на фузија, другите категории кои главно вклучуваат метаболизам на аминокиселини се значително зголемени, што е во согласност со метаболизмот што се јавува кај митохондријалните PN. Пренасочувањето е конзистентно.
(A) Репрезентативни конфокални фотографии од церебеларни делови на глувци CTRL и Mfn2cKO кои покажуваат прогресивна загуба на PNs (калбиндин, сива); јадрата беа контрабоени со DAPI. (B) Квантификација на (A) (еднонасочна анализа на варијанса, ***P<0,001; n = 4 до 6 кругови од три глувци). (C) Експериментален работен тек. (D) Распределба на топлинската мапа на маркери специфични за Пуркиниевите (горе) и други типови клетки (средина). (E) Вен дијаграм што го покажува бројот на митохондријални протеини идентификувани во класифицираната PN. (F) Вулкански графикон на диференцијално експресирани протеини во Mfn2cKO неврони на 8 недели (гранична вредност на значајност од 1,3). (G) Анализата на патеките на креативност ги покажува петте најважни патеки на нагорна регулација (црвена) и надолна регулација (сина) во Mfn2cKO PN класифицирана како 8 недели. Прикажано е просечното ниво на експресија на секој детектиран протеин. Топлинска мапа во сива скала: прилагодена P вредност. ns, не е важно.
Податоците од протеомика покажаа дека протеинската експресија на комплексите I, III и IV постепено се намалувала. Комплексите I, III и IV содржеле есенцијални mtDNA-кодирани подгрупи, додека комплексот II, кој бил само нуклеарно кодиран, во основа не бил засегнат (Слика 2A и Слика S2A). Во согласност со протеомските резултати, имунохистохемијата на делови од церебеларното ткиво покажала дека нивото на MTCO1 (митохондријална цитохром C оксидазна подгрупа 1) на комплексот IV во PN постепено се намалувало (Слика 2B). mtDNA-кодирана подгрупа Mtatp8 била значително намалена (Слика S2A), додека нивото на стабилна состојба на нуклеарно-кодирана ATP синтазна подгрупа останало непроменето, што е во согласност со познатиот стабилен комплекс F1 на ATP синтазна подгрупа кога експресијата на mtDNA е стабилна. Формирањето е конзистентно. Прекин (7). Евалуацијата на нивото на mtDNA кај сортираните Mfn2cKO PNs со полимеразна верижна реакција во реално време (qPCR) потврди постепено намалување на бројот на копии на mtDNA. Во споредба со контролната група, на возраст од 8 недели, само околу 20% од нивото на mtDNA беше задржано (Слика 2C). Во согласност со овие резултати, боењето со конфокална микроскопија на Mfn2cKO PNs беше користено за откривање на ДНК, покажувајќи ја временски зависната потрошувачка на митохондријални нуклеотиди (Слика 2D). Откривме дека само некои кандидати вклучени во деградацијата на митохондријалните протеини и одговорот на стрес беа зголемени, вклучувајќи ги Lonp1, Afg3l2 и Clpx, и факторите на склопување на комплексот OXPHOS. Не беа откриени значајни промени во нивоата на протеини вклучени во апоптозата (Слика S2B). Слично на тоа, откривме дека каналите на митохондријата и ендоплазматскиот ретикулум вклучени во транспортот на калциум имаат само мали промени (Слика S2C). Дополнително, евалуацијата на протеините поврзани со автофагијата не откри значајни промени, што е во согласност со видливата индукција на автофагозоми забележана in vivo со имунохистохемија и електронска микроскопија (Слика S3). Сепак, прогресивната OXPHOS дисфункција кај PNs е придружена со очигледни ултраструктурни митохондријални промени. Митохондријалните кластери може да се видат во клеточните тела и дендритичните дрвја на Mfn2cKO PNs на возраст од 5 и 8 недели, а внатрешната мембранска структура претрпе длабоки промени (Слика S4, A и B). Во согласност со овие ултраструктурни промени и значителното намалување на mtDNA, анализата на акутни церебеларни парчиња со тетраметилродамин метил естер (TMRM) покажа дека потенцијалот на митохондријалната мембрана кај Mfn2cKO PNs е значително намален (Слика S4C).
(A) Анализа на временскиот тек на нивото на експресија на комплексот OXPHOS. Разгледајте само протеини со P<0,05 на 8 недели (двонасочна ANOVA). Испрекината линија: Нема прилагодување во споредба со CTRL. (B) Лево: Пример на церебеларен дел обележан со анти-MTCO1 антитело (скала лента, 20 μm). Површината окупирана од тела на Пуркиниевите клетки е покриена со жолта боја. Десно: Квантификација на нивоата на MTCO1 (еднонасочна анализа на варијанса; n = 7 до 20 клетки анализирани од три глувци). (C) qPCR анализа на бројот на копии на mtDNA во сортираната PN (еднонасочна анализа на варијанса; n = 3 до 7 глувци). (D) Лево: Пример на церебеларен дел обележан со анти-ДНК антитело (скала лента, 20 μm). Површината окупирана од тела на Пуркиниевите клетки е покриена со жолта боја. Десно: Квантификација на лезии на mtDNA (еднонасочна анализа на варијанса; n = 5 до 9 клетки од три глувци). (E) Пример за акутен церебеларен пресек што ги прикажува mitoYFP + Пуркиниевите клетки (стрелка) во снимање со клешта за цели клетки. (F) Квантификација на IV кривата. (G) Репрезентативни снимки на инјектирање на деполаризирачка струја во CTRL и Mfn2cKO Пуркиниевите клетки. Горна трага: Првиот пулс што го активирал AP. Долна трага: Максимална AP фреквенција. (H) Квантификација на постсинаптички спонтани влезови (sPSPs). Репрезентативната трага на снимање и нејзиниот сооднос на зумирање се прикажани во (I). Еднонасочната анализа на варијансата анализирала n = 5 до 20 клетки од три глувци. Податоците се изразени како средна вредност ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Репрезентативни траги на спонтан AP снимен со користење на режимот на перфорирана клешта за зумирање. Горна трага: Максимална AP фреквенција. Долна трага: зумирање на еден AP. (K) Квантификувајте ја просечната и максималната AP фреквенција според (J). Ман-Витни тест; n = 5 клетки беа анализирани од четири глувци. Податоците се изразени како средна вредност ± SEM; не е важно.
Кај 8-неделниот Mfn2cKO PN беше откриено очигледно оштетување на OXPHOS, што укажува дека физиолошката функција на невроните е сериозно абнормална. Затоа, ги анализиравме пасивните електрични карактеристики на невроните со недостаток на OXPHOS на 4 до 5 недели и 7 до 8 недели со вршење на снимки на цели клетки во акутни церебеларни пресеци (Слика 2E). Неочекувано, просечниот мембрански потенцијал во мирување и влезниот отпор на Mfn2cKO невроните беа слични на контролната група, иако имаше суптилни разлики помеѓу клетките (Табела 1). Слично на тоа, на возраст од 4 до 5 недели, не беа пронајдени значајни промени во односот струја-напон (IV крива) (Слика 2F). Сепак, ниеден Mfn2cKO неврон на возраст од 7 до 8 недели не го преживеал IV режимот (чекор на хиперполаризација), што укажува дека постои јасна чувствителност на потенцијалот за хиперполаризација во оваа доцна фаза. Спротивно на тоа, кај Mfn2cKO невроните, деполаризирачките струи што предизвикуваат повторувачки празнења на акциониот потенцијал (AP) се добро толерирани, што укажува дека нивните целокупни модели на празнење не се значително различни од оние на контролните неврони стари 8 недели (Табела 1 и Слика 2G). Слично, фреквенцијата и амплитудата на спонтаните постсинаптички струи (sPSC) беа споредливи со оние на контролната група, а фреквенцијата на настаните се зголеми од 4 недели на 5 недели до 7 недели на 8 недели со слично зголемување (Слика 2, H и I). Периодот на синаптичко созревање кај PN (25). Слични резултати се добиени по перфорирани PN делови. Оваа конфигурација спречува можна компензација на клеточните ATP дефекти, како што може да се случи при снимање на цела клетка со клешта. Особено, мембранскиот потенцијал во мирување и фреквенцијата на спонтано активирање на Mfn2cKO невроните не беа засегнати (Слика 2, J и K). Накратко, овие резултати укажуваат дека ПН со очигледна OXPHOS дисфункција можат добро да се справат со моделите на високофреквентно празнење, што укажува дека постои механизам за компензација што им овозможува да одржуваат речиси нормални електрофизиолошки одговори.
Податоците се изразени како средна вредност ± SEM (еднонасочна анализа на варијансата, тест за повеќекратна споредба на Холм-Сидак; *P<0,05). Бројот на единицата е означен со загради.
Се обидовме да истражиме дали која било категорија во базата на податоци за протеомика (Слика 1G) вклучува патишта што можат да го неутрализираат тешкиот недостаток на OXPHOS, со што објаснуваме зошто засегнатата периферна нефропатија може да одржи речиси нормална електрофизиологија (Слика 2, од Е до К). Протеомичката анализа покажа дека ензимите вклучени во катаболизмот на аминокиселините со разгранет ланец (BCAA) беа значително зголемени (Слика 3A и Слика S5A), а финалниот производ ацетил-CoA (CoA) или сукцинил CoA може да ги надополни трикарбоксилатите во циклусот на артериосклерозна киселина (TCA). Откривме дека содржината на BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) и BCAT2 се зголемила. Тие го катализираат првиот чекор од катаболизмот на BCAA со генерирање глутамат од α-кетоглутарат (26). Сите подединици што го сочинуваат комплексот на кето киселина дехидрогеназа со разгранет ланец (BCKD) се зголемено активирани (комплексот катализира последователна и неповратна декарбоксилација на добиениот јаглероден скелет на BCAA) (Слика 3A и Слика S5A). Сепак, не се пронајдени очигледни промени во самата BCAA во сортираната PN, што може да се должи на зголемената клеточна апсорпција на овие есенцијални аминокиселини или употребата на други извори (гликоза или млечна киселина) за дополнување на TCA циклусот (Слика S5B). PN-ите на кои им недостасува OXPHOS, исто така, покажаа зголемена активност на разградување на глутамин и трансаминација на 8 недели возраст, што може да се одрази со зголемената активност на митохондријалните ензими глутаминаза (GLS) и глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) (Слика 3, A и C). Вреди да се напомене дека зголемената регулација на GLS е ограничена на сплајсираната изоформа глутаминаза C (GLS-GAC) (промената на Mfn2cKO/CTRL е приближно 4,5 пати поголема, P = 0,05), а нејзината специфична зголемена регулација во ткивата на ракот може да ја поддржи митохондријалната биоенергија. (27).
(A) Топлинската мапа ја покажува промената на нивото на протеини за наведениот пат на 8 недели. (B) Пример за церебеларен дел обележан со анти-PCx антитело (скала, 20 μm). Жолтата стрелка покажува кон телото на Пуркиниевите клетки. (C) Анализа на временскиот тек на експресијата на протеините идентификувана како важен кандидат за атеросклероза (повеќекратен t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 глувци). (D) Горе: Шематски дијаграм што ги прикажува различните начини на внесување на обележаниот јаглерод содржан во трасерот на [1-13C]пируват (т.е. преку PDH или транс-артериски пат). Долу: Графиконот за виолина го покажува процентот на едно обележан јаглерод (M1) конвертиран во аспарагинска киселина, лимонска киселина и јаболкова киселина по обележувањето на акутните церебеларни делови со [1-13C]пируват (спарен t-тест; ** P <0,01). (E) Сеопфатна анализа на временската историја на наведениот пат. Разгледајте ги само протеините со P<0,05 на 8 недели. Испрекината линија: нема вредност за прилагодување (двонасочна анализа на варијансата; * P <0,05; *** P <0,001). Податоците се изразени како средна вредност ± SEM.
Во нашата анализа, катаболизмот на BCAA стана еден од клучните патишта за зголемување на регулацијата. Овој факт силно сугерира дека волуменот на вентилација што влегува во циклусот на TCA може да се промени кај PN без OXPHOS. Ова може да претставува главна форма на невронално метаболичко пренасочување, што може да има директно влијание врз невронската физиологија и преживување за време на одржувањето на тешка дисфункција на OXPHOS. Во согласност со оваа хипотеза, откривме дека главниот антиатеросклеротичен ензим PCx е зголемен (Mfn2cKO/CTRL се менува приближно 1,5 пати; Слика 3А), што катализира конверзија на пируват во оксалоацетат (28), за кој се верува дека е во мозочното ткиво. Експресијата во е ограничена на астроцити (29, 30). Во согласност со резултатите од протеомика, конфокалната микроскопија покажа дека експресијата на PCx е специфично и значително зголемена кај PN со недостаток на OXPHOS, додека реактивноста на PCx е главно ограничена на соседните Бергманови глијални клетки од контролата (Слика 3Б). За функционално тестирање на набљудуваната зголемена регулација на PCx, третиравме акутни церебеларни парчиња со трасер [1-13C]пируват. Кога пируватот се оксидираше од пируват дехидрогеназа (PDH), неговата изотопска ознака исчезна, но е инкорпориран во меѓупроизводите на TCA циклусот кога пируватот се метаболизира преку васкуларни реакции (Слика 3D). Во поддршка на нашите протеомички податоци, забележавме голем број маркери од овој трасер во аспарагинската киселина на парчињата Mfn2cKO, додека лимонската киселина и јаболковата киселина исто така имаа умерен тренд, иако не значаен (Слика 3D).
Кај допаминските неврони на глувците MitoPark со митохондријална дисфункција предизвикана од допамински неврони кои специфично го уништуваат генот за митохондријален транскрипциски фактор А (Tfam) (Слика S6B), експресијата на PCx исто така беше значително зголемена (31), што укажува дека појавата на болеста е регулирана за време на дисфункцијата на невроналниот OXPHOS во телото. Вреди да се напомене дека е откриено дека уникатните ензими (32-34) кои можат да бидат експресирани во неврони кои можат да бидат поврзани со артериосклероза се значително зголемени кај PN кои немаат OXPHOS, како што се пропионил-CoA карбоксилазата (PCC-A), малонил-CoA го претвора пропионил-CoA во сукцинил-CoA и митохондријалниот јаболков ензим 3 (ME3), чија главна улога е да го обноват пируватот од малат (Слика 3, A и C) (33, 35). Дополнително, откривме значително зголемување на ензимот Pdk3, кој фосфорилира и на тој начин го инактивира PDH (36), додека не беа откриени промени во ензимот Pdp1 кој го активира PDH или самиот ензимски комплекс PDH (Слика 3А). Конзистентно, кај Mern2cKO PNs, фосфорилацијата на α1 подгрупата α (PDHE1α) подгрупата на пируват дехидрогеназа E1 компонентата на PDH комплексот во Ser293 (познато дека ја инхибира ензимската активност на PDH) беше подобрена (Слика S6C) (Слика S6C). Пируватот нема васкуларен пристап.
Конечно, откривме дека супер патеката на биосинтеза на серин и глицин, поврзаниот митохондријален циклус на фолати (1C) и биосинтезата на пролин (Слика 1G и Слика S5C) се значително зголемени, според извештаите, за време на процесот на активирање. Околните ткива се активираат со митохондријална дисфункција (5-7). Конфокалната анализа што ги поддржува овие протеомски податоци покажа дека кај периферна перисталтика со отсуство на OXPHOS, церебеларните парчиња на глувци стари 8 недели биле подложени на серин хидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2), клучен ензим на митохондријалниот циклус на фолати. Значаен имунолошки одговор (Слика S5D). Кај 13 акутни церебеларни парчиња инкубирани со CU-глукоза, експериментите со метаболичко следење дополнително ја потврдија зголемената биосинтеза на серин и пролин, што укажува дека протокот на јаглеродни изоформи во серин и пролин се зголемил (Слика S5E). Бидејќи реакциите што ги промовираат GLS и GPT2 се одговорни за синтезата на глутамат од глутамин и трансаминацијата помеѓу глутамат и α-кетоглутарат, нивната зголемена регулација укажува дека невроните со недостаток на OXPHOS имаат зголемена побарувачка за глутамат. Ова може да биде насочено кон одржување на зголемената биосинтеза на пролин (Слика S5C). За разлика од овие промени, протеомската анализа на церебеларните астроцити од PN-специфични глувци Mfn2cKO покажа дека овие патишта (вклучувајќи ги сите антипероксидази) не се промениле значително во експресијата, со што се демонстрира дека ова метаболичко пренасочување е селективно кон деградиран PN (Слика S6, D до G).
Накратко, овие анализи открија значително различни модели на временска активација на специфични метаболички патишта кај ПН. Иако абнормалната невронска митохондријална функција може да доведе до рана атеросклероза и ремоделирање на 1C (Слика 3E и Слика S5C), па дури и до предвидливи промени во експресијата на комплексите I и IV, промените во синтезата на серин de novo се само во доцните фази. OXPHOS дисфункција (Слика 3E и Слика S5C). Овие наоди дефинираат секвенцијален процес во кој митохондријалните (1C циклус) и цитоплазматските (серин биосинтеза) предизвикани од стрес реагираат синергистички со зголемувањето на атеросклерозата во циклусот на TCA за да го преобликуваат невронскиот метаболизам.
8-неделните PN со недостаток на OXPHOS можат да одржуваат високофреквентна активност на ексцитација и да претрпат значајно метаболичко повторно поврзување за да компензираат митохондријална дисфункција. Ова откритие отвора интересна можност дека дури и во овој момент, овие клетки можат да добијат и терапевтска интервенција за одложување или спречување на невродегенерација. Доцна. Ја решивме оваа можност преку две независни интервенции. Во првиот метод, дизајниравме Cre-зависен адено-асоциран вирус (AAV) вектор, така што MFN2 може селективно да се експресира во OXPHOS-дефицитарни PN in vivo (Слика S7A). AAV што кодира MFN2 и флуоресцентниот репортерски ген mCherry (Mfn2-AAV) беа потврдени во примарни невронски култури in vitro, што предизвика MFN2 да се експресира на Cre-зависен начин и ја спаси митохондријалната морфологија, со што се спречува невромутација кај Mfn2cKO невроните (Слика S7, B, D и E). Потоа, спроведовме in vivo експерименти за стереотактичко доставување на 8-неделна Mfn2-AAV во церебеларниот кортекс на глувци Mfn2cKO и контролни глувци, и анализиравме глувци стари 12 недели (Слика 4A). Третираните глувци Mfn2cKO умреа (Слика 1, A и B) (16). Вирусната трансдукција in vivo резултираше со селективна експресија на PN во некои церебеларни кругови (Слика S7, G и H). Инјектирањето на контролниот AAV што експресира само mCherry (Ctrl-AAV) немаше значаен ефект врз степенот на невродегенерација кај животните Mfn2cKO. Спротивно на тоа, анализата на Mfn2cKO трансдуцирани со Mfn2-AAV покажа значаен заштитен ефект на слојот на PN клетките (Слика 4, B и C). Особено, густината на невроните се чини дека е речиси неразлична од контролните животни (Слика 4, B и C, и Слика S7, H и I). Експресијата на MFN1, но не и на MFN2, е подеднакво ефикасна во спречувањето на невронската смрт (Слика 4C и Слика S7, C и F), што укажува дека експресијата на ектопичниот MFN1 може ефикасно да го надополни недостатокот на MFN2. Понатамошната анализа на единечно ниво на PN покажа дека Mfn2-AAV во голема мера ја спасил ултраструктурата на митохондриите, ги нормализирал нивоата на mtDNA и ја променил високата експресија на маркерот PCx против ангиогенеза (Слика 4, C до E). Визуелната инспекција на спасените глувци Mfn2cKO во состојба на мирување покажала дека нивното држење на телото и моторните симптоми (движење од S1 до S3) се подобрени. Како заклучок, овие експерименти покажуваат дека одложеното повторно воведување на MFN2 во PN со сериозен недостаток на OXPHOS е доволно за да се врати потрошувачката на mtDNA и да се предизвика атеросклероза, со што се спречува дегенерација на аксонот и невронска смрт in vivo.
(A) Шема што го прикажува експерименталниот распоред за инјектирање на AAV што кодира MFN2 кога е активиран наведениот метаболички пат. (B) Репрезентативни конфокални слики од 12-неделни церебеларни парчиња трансдуцирани на 8 недели кај глувци Mfn2cKO и обележани со антитело против Калбиндин. Десно: Скалирање на аксонските влакна. Скалата на аксонскиот зум е 450 и 75 μm. (C) Лево: Квантификација на густината на Пуркиниевите клетки во AAV трансдукциската јамка (AAV+) (еднонасочна анализа на варијанса; n = 3 глувци). Десно: анализа на фокусот на mtDNA кај трансдуциран PN во 12-та недела (неспарен t-тест; n = 6 клетки од три глувци). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Репрезентативни трансмисиони електронски микрографии на PN на Mfn2cKO церебеларни делови трансдуцирани со наведените вирусни вектори. Розовата маска ја илустрира површината окупирана од дендрити, а жолтиот испрекинат квадрат го илустрира зумот даден од десно; n го претставува јадрото. Скала, 1μm. (E) покажува пример за PCx боење во PN трансдуцирано на 12 недели. Скала, 20μm. OE, прекумерна експресија; FC, промена на превиткувањето.
Конечно, ја истраживме важноста на преживувањето на клетките индуцирано од пероксидаза кај ПН кои доживеале OXPHOS дисфункција. Генериравме mCherry што кодира AAV-shRNA (кратка РНК во облик на шнола) специфично насочена кон глувчешка PCx mRNA (AAV-shPCx) и го инјектиравме вирусот или неговата измешана контрола (AAV-scr) во малиот мозок на глувци Mfn2cKO. Инјекцијата беше извршена во четвртата недела од животот (Слика 5А) за да се постигне ефикасно намалување на PCx во периодот кога експресијата на PCx се зголеми (Слика 3C) и слојот на ПН клетките беше сè уште недопрен (Слика 1А). Вреди да се напомене дека намалувањето на PCx (Слика S8A) доведува до значително забрзување на смртта на ПН, што е ограничено на инфицираниот прстен (Слика 5, Б и В). За да го разбереме механизмот на метаболичките ефекти предизвикани од зголемената регулација на PCx, го проучивме редокс статусот на PN откако PCx knockdown и AAV-посредуваниот оптички биосензор Grx1-roGFP2 беа истовремено експресирани (Слика S8, B до D) за да ја процениме релативната промена на потенцијалот на пептидниот редокс на глутатион (38). Потоа, извршивме двофотонска флуоресцентна микроскопија за снимање во живот (FLIM) во акутни парчиња мозок на 7-неделни Mfn2cKO или контролни легла за да откриеме потенцијални промени во цитоплазматскиот редокс статус по верификација на FLIM условите (Слика S8, E до G). Анализата покажа значително зголемување на оксидациската состојба на единечни Mfn2cKO PN без PCx експресија, што е различно од контролните неврони или Mfn2cKO PN кои експресираат само измешана shRNA (Слика 5, D и E). Кога експресијата на PCx беше намалена, процентот на Mfn2cKO PNs кои покажуваат високо оксидирана состојба се зголеми за повеќе од три пати (Слика 5E), што укажува дека зголемената регулација на PCx го одржува редокс капацитетот на дегенерираните неврони.
(A) Шема што го прикажува експерименталниот распоред за инјектирање на AAV што кодира shPCx кога е активиран наведениот метаболички пат. (B) Репрезентативни конфокални фотографии од 8-неделни церебеларни пресеци кај глувци Mfn2cKO трансдуцирани и обележани со антитело против калцинеурин на 4 недели. Скала, 450μm. (C) Квантификација на густината на Пуркиниевите клетки во AAV-трансдуцирани јамки (еднонасочна анализа на варијанса; n = 3 до 4 глувци). Податоците се изразени како средна вредност ± SEM; ***P<0,001. (D) Репрезентативната FLIM слика го покажува просечниот животен век на 7-неделни PN што експресира глутатион редокс сензор Grx1-roGFP2 под наведените експериментални услови. Однос LUT (табела за пребарување): временски интервал на преживување (во пикосекунди). Скала, 25μm. (E) Хистограмот ја покажува распределбата на вредностите на животниот век на Grx1-roGFP2 од (D) (n = 158 до 368 клетки кај два глувци под секоја состојба). Кружниот дијаграм над секој хистограм: го покажува бројот на клетки со значително подолги (црвени, оксидирани) или пократки (сини, намалени) вредности на животниот век, кои надминуваат 1 SD од просечната вредност на животниот век во CTRL-AAV-scr. (F) Предложениот модел го покажува заштитниот ефект на зголемената регулација на невроналниот PCx.
Сè на сè, податоците што ги даваме овде покажуваат дека повторната експресија на MFN2 може целосно да го спаси напредниот PN со тежок недостаток на OXPHOS, тешко осиромашување на mtDNA и екстремно абнормална морфологија слична на ista, со што се обезбедува континуиран напредок дури и кај напредни болести. Невродегенерацијата обезбедува реверзибилен доказ за фазата пред клеточната смрт. Овој степен на метаболичка флексибилност е дополнително нагласен со способноста на невроните да индуцираат атеросклероза (пренасочување на TCA циклусот), што ја инхибира експресијата на PCx кај PN на кои им недостасува OXPHOS и ја засилува клеточната смрт, со што игра заштитна улога (Слика 5F).
Во оваа студија, обезбедивме докази дека одговорот на PN на дисфункцијата на OXPHOS е постепено да се конвергира кон атеросклероза од циклусот TCA преку диференцијалниот пат на активирање активиран од метаболички програми. Ја потврдивме протеомската анализа со многу комплементарни методи и откривме дека кога се предизвикани од тешка митохондријална дисфункција, невроните имаат претходно непозната форма на метаболичка еластичност. За наше изненадување, целиот процес на пренасочување не мора нужно да ја означува терминалната метаболичка состојба што ја придружува невродегенерацијата постепено и неповратно, но нашите податоци сугерираат дека тој може да претставува неврон за одржување дури и во фазата пред клеточната смрт. Механизам за функционална компензација. Ова откритие укажува дека невроните имаат значителен степен на метаболичка пластичност во телото. Овој факт докажува дека подоцнежното повторно воведување на MFN2 може да ја поништи експресијата на клучните метаболички маркери и да спречи дегенерација на PN. Напротив, ја инхибира атеросклерозата и ги забрзува нервите. транссексуалец.
Едно од најфасцинантните откритија во нашето истражување е дека периферните неврони на кои им недостасува OXPHOS можат да го модифицираат метаболизмот на циклусот на TCA со зголемување на активноста на ензимите кои специфично ја стимулираат артериосклерозата. Метаболното преуредување е честа карактеристика на клетките на ракот, од кои некои се потпираат на глутамин за да ги надополнат меѓупроизводите на циклусот на TCA за да произведат редуцирачки еквиваленти, кои го движат респираторниот ланец и го одржуваат производството на прекурсори на биосинтезата на липиди и нуклеотиди (39, 40). Неодамнешна студија покажа дека во периферните ткива кои доживуваат дисфункција на OXPHOS, повторното поврзување на метаболизмот на глутамин/глутамат е исто така истакната карактеристика (5, 41), каде што насоката на влегување на глутамин во циклусот на TCA зависи од сериозноста на повредата од OXPHOS (41). Сепак, недостасуваат јасни докази за каква било сличност на невронската метаболичка пластичност во телото и нејзината можна релевантност во контекст на болеста. Во неодамнешна студија in vitro, беше покажано дека примарните кортикални неврони мобилизираат базени на глутамат за невротрансмисија, со што се промовира оксидативен метаболизам и атеросклероза под услови на метаболички стрес (42). Вреди да се напомене дека под фармаколошка инхибиција на ензимот сукцинат дехидрогеназа на циклусот на TCA, се верува дека пируват карбоксилацијата ја одржува синтезата на оксалоацетат во култивирани неврони на церебеларни гранули (34). Сепак, физиолошката релевантност на овие механизми за мозочното ткиво (каде што се верува дека атеросклерозата е главно ограничена на астроцитите) сè уште има важно физиолошко значење (43). Во овој случај, нашите податоци покажуваат дека ПН оштетени од OXPHOS во телото можат да се префрлат на деградација на BCAA и пируват карбоксилација, кои се двата главни извори на дополнување на меѓупроизводи од базенот TCA. Иако е предложен претпоставениот придонес на катаболизмот на BCAA во метаболизмот на невронската енергија, покрај улогата на глутамат и GABA за невротрансмисија (44), сè уште нема докази за овие механизми in vivo. Затоа, лесно е да се шпекулира дека нефункционалните ПН можат автоматски да ја компензираат потрошувачката на меѓупроизводи на TCA предизвикана од процесот на асимилација со зголемување на атеросклерозата. Особено, зголемената регулација на PCx може да биде потребна за да се одржи зголемената побарувачка за аспарагинска киселина, што е сугерирано кај пролиферирачките клетки со митохондријална дисфункција (45). Сепак, нашата метаболомичка анализа не откри никакви значајни промени во нивото на стабилна состојба на аспарагинска киселина кај Mfn2cKO PNs (Слика S6A), што веројатно го одразува различното метаболичко искористување на аспарагинската киселина помеѓу пролиферирачките клетки и постмитотичните неврони. Иако точниот механизам на зголемената регулација на PCx кај нефункционалните неврони in vivo останува да се карактеризира, покажавме дека овој предвремен одговор игра важна улога во одржувањето на редокс состојбата на невроните, што беше демонстрирано во FLIM експериментите на церебеларни парчиња. Особено, спречувањето на PNs да ја зголемат регулацијата на PCx може да доведе до пооксидирана состојба и да ја забрза клеточната смрт. Активирањето на деградацијата на BCAA и карбоксилацијата на пируватот не се начини за карактеризирање на периферните ткива со митохондријална дисфункција (7). Затоа, тие се чини дека се приоритетна карактеристика на невроните со недостаток на OXPHOS, дури и ако не се единствената карактеристика, што е важно за невродегенерацијата.
Церебеларната болест е хетероген вид на невродегенеративна болест која обично се манифестира како атаксија и често ги оштетува ПН (46). Оваа популација на неврони е особено ранлива на митохондријална дисфункција бидејќи нивната селективна дегенерација кај глувците е доволна за да репродуцира многу од моторните симптоми што ја карактеризираат човечката спиноцеребеларна атаксија (16, 47, 48). Според извештаите, трансгенски модел на глувци со мутант ген е поврзан со човечка спиноцеребеларна атаксија и има митохондријална дисфункција (49, 50), нагласувајќи ја важноста на проучувањето на последиците од недостатокот на OXPHOS кај ПНПХ. Затоа, особено е погодно ефикасно да се изолира и проучува оваа единствена популација на неврони. Сепак, со оглед на тоа што ПН се многу чувствителни на притисок и сочинуваат мал дел од целата популација на церебеларни клетки, за многу студии базирани на омика, селективното одвојување на нив како цели клетки е сè уште предизвикувачки аспект. Иако е речиси невозможно да се постигне апсолутна отсуство на контаминација на други типови клетки (особено возрасни ткива), комбиниравме ефикасен чекор на дисоцијација со FACS за да добиеме доволен број на одржливи неврони за анализа на протеомика низводно, и имаме доста висока покриеност со протеини (околу 3000 протеини) во споредба со постојниот збир на податоци од целиот мал мозок (51). Со зачувување на одржливоста на цели клетки, методот што го нудиме овде ни овозможува не само да ги провериме промените во метаболичките патишта во митохондриите, туку и да ги провериме промените во неговите цитоплазматски еквиваленти, што ја надополнува употребата на митохондријални мембрански ознаки за збогатување на типот на клетките. Новиот метод за бројот на митохондрии во сложените ткива (52, 53). Методот што го опишуваме не е поврзан само со проучувањето на Пуркиниевите клетки, туку може лесно да се примени на кој било тип на клетка за да се решат метаболичките промени кај заболените мозоци, вклучително и други модели на митохондријална дисфункција.
Конечно, идентификувавме терапевтски прозорец за време на овој процес на метаболичко преуредување што може целосно да ги поништи клучните знаци на клеточен стрес и да спречи невронска дегенерација. Затоа, разбирањето на функционалните импликации од пренасочувањето опишано овде може да обезбеди фундаментални увиди во можните третмани за одржување на невронската одржливост за време на митохондријална дисфункција. Потребни се идни истражувања насочени кон дисецирање на промените во енергетскиот метаболизам кај други типови мозочни клетки за целосно да се открие применливоста на овој принцип кај други невролошки заболувања.
Глувците MitoPark се опишани претходно (31). Глувците C57BL/6N со loxP странични Mfn2 гени се опишани претходно (18) и вкрстени со L7-Cre глувци (23). Добиените двојно хетерозиготни потомци потоа беа вкрстени со хомозиготни Mfn2loxP/Mfn2loxP глувци за да се генерираат Пуркиние-специфични генски нокаути за Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Во подгрупа на парење, алелот Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) беше воведен преку дополнителни вкрстувања (20). Сите процедури кај животните беа извршени во согласност со европските, националните и институционалните упатства и одобрени од LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Северна Рајна-Вестфалија, Германија. Работата со животни, исто така, ги следи упатствата на Европската федерација на здруженија за лабораториски науки за животни.
По анестезирањето на цервикалната дислокација на бремената жена, ембрионот на глушецот е изолиран (E13). Кортексот е дисециран во Hanks-ов балансиран раствор на сол (HBSS) дополнет со 10 mM Hepes и е внесен во Dulbecco-ов модифициран Eagle's Medium кој содржи папаин (20 U/ml) и цистеин (1μg/ml). Ткивото се инкубира во DMEM) и се дисоцира со ензимско варење (Ml) на 37°C 20 минути, а потоа се меле механички во DMEM дополнет со 10% фетален говедски серум. Клетките се засеани на стаклени покривни плочки обложени со полилизин со густина од 2×106 на сад за култура од 6 cm или со густина од 0,5×105 клетки/cm2 за анализа на слики. По 4 часа, медиумот е заменет со Neurobasal медиум без серум кој содржи 1% додаток на B27 и 0,5 mM GlutaMax. Потоа, невроните беа одржувани на 37°C и 5% CO2 во текот на целиот експеримент и хранети еднаш неделно. За да се индуцира рекомбинација in vitro, 3 μl (сад за култура со 24 бунари) или 0,5 μl (плоча со 24 бунари) од следниот вектор на вирусот AAV9 беше употребен за третирање на невроните на вториот ден in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, каталошки број 105530-AAV9) и AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталошки број 105545-AAV9).
Комплементарната ДНК на глувците Mfn1 и Mfn2 (добиена од плазмидите Addgene #23212 и #23213, соодветно) е обележана со V5 секвенцата (GKPIPNPLLGLDST) на C-терминалот и е споена со mCherry во рамката преку T2A секвенцата. Grx1-roGFP2 е подарок од Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Со замена на касетата tdTomato со користење на конвенционални методи на клонирање, касетата беше субклонирана во 'рбетот pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (референтен број на Addgene 28306) за да се генерираат вектори pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 и pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Слична стратегија беше употребена за генерирање на контролниот вектор pAAV-CAG-FLEX-mCherry. За да се генерира конструкцијата AAV-shPCx, потребен е плазмиден AAV вектор (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), кој ја содржи ДНК секвенцата што ја кодира shRNA што го таргетира глувчешкиот PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Под контрола на U6 промотерот, mCherry се користи под контрола на CMV промотерот. Производството на помошни AAV вектори беше извршено според упатствата на производителот (Cell Biolabs). Накратко, користете трансфер плазмид кој носи mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) транзиторна трансфекција на генот за кодирање на 293AAV клетки-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) или Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), како и кодирање на капсидниот протеин AAV1 и плазмидот за пакување на помошен протеин, користејќи метод на калциум фосфат. Суровиот вирусен супернатант е добиен со циклуси на замрзнување-одмрзнување во бања со сув мраз/етанол и лизирани клетки во фосфатен пуферски солен раствор (PBS). AAV векторот беше прочистен со дисконтинуирано ултрацентрифугирање со градиент на јодиксанол (24 часа на 32.000 вртежи во минута и 4°C) и концентриран со употреба на центрифугален филтер Amicon ultra-15. Титарот на геномот на AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 копија на геномот (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX беше како што беше претходно опишано (54), мерено со квантитативна PCR во реално време (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) и AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Примарните неврони беа стружени во ледено ладен 1x PBS, пелетирани, а потоа хомогенизирани во 0,5% Triton X-100 / 0,5% натриум деоксихолат/PBS бафер за лиза што содржи фосфатаза и инхибитор на протеаза (Roche). Квантификацијата на протеините беше извршена со користење на анализа на бицинхонинска киселина (Thermo Fisher Scientific). Потоа, протеините беа одделени со електрофореза на SDS-полиакриламид гел, а потоа размачкани на мембрана од поливинилиден флуорид (GE Healthcare). Блокирајте ги неспецифичните места и инкубирајте со примарното антитело (видете ја Табела S1 за детали) во 5% млеко во TBST (Tris-пуфериран физиолошки раствор со Tween), чекори на миење и секундарно антитело во TBST инкубација. Инкубирајте со примарното антитело преку ноќ на +4°C. По миењето, нанесете го секундарното антитело 2 часа на собна температура. Последователно, со инкубирање на истото размачкување со анти-β-актин антитело, беше потврдено истото оптоварување. Детекција со претворање во хемилуминисценција и засилување на хемилуминисценцијата (GE Healthcare).
Невроните претходно засеани на стаклени покривни плочки беа фиксирани со 4% параформалдехид (PFA)/PBS во наведеното време на собна температура во тек на 10 минути. Покривните плочки прво се перметираат со 0,1% Triton X-100/PBS во тек на 5 минути на собна температура, а потоа во блокирачки пуфер [3% говедски серумски албумин (BSA)/PBS]. Вториот ден, покривните плочки беа измиени со блокирачки пуфер и инкубирани со соодветното секундарно антитело конјугирано со флуорофор во тек на 2 часа на собна температура; конечно, примероците беа темелно измиени во PBS со 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) кој беше контрабоен, а потоа фиксирани на микроскопското стакло со Aqua-Poly/Mount.
Глувците (машки и женски) беа анестезирани со интраперитонеална инјекција на кетамин (130 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg) и администрирани поткожно со аналгетик карпрофен (5 mg/kg) и поставени во стереотактичен инструмент (Kopf) опремен со топла влошка. Разоткријте го черепот и користете забна дупчалка за да го истенчите делот од церебеларниот кортекс што одговара на мис коската (од ламбда: опашка 1,8, латерален 1, што одговара на лобулите IV и V). Користете закривена игла за шприц за внимателно да создадете мала дупка во черепот за да избегнете нарушување на васкулатурата подолу. Потоа тенкиот нацртан стаклен капилар полека се вметнува во микро-дупката (од -1,3 до -1 на вентралната страна на дура матер), а 200 до 300 nl AAV се инјектира во микро-инјекторот (Narishige) со рачни шприцеви (Narishige) неколку пати под низок притисок во временски период од 10 до 20 минути. По инфузијата, ставете го капиларот уште 10 минути за да му овозможите на вирусот целосно да се прошири. Откако ќе се повлечат капиларите, кожата внимателно се шие за да се минимизира воспалението на раната и да му се овозможи на животното да се опорави. Животните биле третирани со аналгетици (каспофен) неколку дена по операцијата, во кое време нивната физичка состојба била внимателно следена, а потоа биле еутанизирани во наведеното време. Сите процедури биле спроведени во согласност со европските, националните и институционалните упатства и биле одобрени од LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Северна Рајна-Вестфалија, Германија.
Животните беа анестезирани со кетамин (100 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg), а срцето прво беше перфузирано со 0,1 M PBS, а потоа со 4% PFA во PBS. Ткивото беше дисецирано и фиксирано во 4% PFA/PBS преку ноќ на 4°C. Вибрирачки нож (Leica Microsystems GmbH, Виена, Австрија) беше користен за подготовка на сагитални пресеци (дебелина од 50 μm) од фиксираниот мозок во PBS. Освен ако не е поинаку наведено, боењето на слободно лебдечките пресеци беше извршено како што е опишано погоре (13) на собна температура и мешање. Накратко, прво, добиените парчиња беа пермеабилизирани со 0,5% Triton X-100/PBS 15 минути на собна температура; за некои епитопи (Pcx и Shmt2), со трис-EDTA пуфер на 80°C (pH 9) загревајте ги парчињата 25 минути наместо овој чекор. Потоа, деловите беа инкубирани со примарно антитело (видете Табела S1) во блокирачки пуфер (3% BSA/PBS) на 4°C преку ноќ со мешање. Следниот ден, деловите беа измиени со блокирачки пуфер и инкубирани со соодветното секундарно антитело конјугирано со флуорофор 2 часа на собна температура; конечно, деловите беа темелно измиени во PBS, контра-боени со DAPI, а потоа фиксирани со AquaPolymount на микроскопско стакло.
За снимање на примерокот беше користен ласерски скенирачки конфокален микроскоп (TCS SP8-X или TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) опремен со ласер со бела светлина и ултравиолетов ласер со диоди од 405. Со возбудување на флуорофорот и собирање на сигналот со хибриден детектор (HyDs), софтверот LAS-X беше користен за собирање на наредени слики во согласност со Nyquist семплирањето во секвенцијален режим: за неквантитативни панели, станува збор за високо динамични сигнали (на пример, во соматски клетки и дендрити) mtYFP (користете HyD за да го детектирате бројот на PN во BrightR режим). Гејтинг од 0,3 до 6 ns се применува за намалување на позадината.
Сликање во реално време на сортирани клетки. По сортирањето во медиум Neurobasal-A што содржи 1% додаток B27 и 0,5 mM GlutaMax, клетките веднаш беа засеани на стаклени плочки обложени со поли-l-лизин (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталошки број 80826), а потоа се чуваа на 37°C и 5% CO2 1 час за да им се овозможи на клетките да се наталожат. Сликањето во реално време беше извршено на конфокален микроскоп со ласерско скенирање Leica SP8 опремен со бел ласер, HyD, леќа со маслено поле 63×[1,4 нумерички отвор (NA)] и фаза за загревање.
Глушецот беше брзо анестезиран со јаглерод диоксид и обезглавен, мозокот беше брзо отстранет од черепот и исечен на сагитален пресек со дебелина од 200 μm (за експеримент со обележување со 13C) или 275 μm (за експерименти со два фотона) исполнет со следниве материјали. Сладоледот (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германија) е исполнет со следниве супстанции: 125 mM ледено ладен, заситен со јаглерод (95% O2 и 5% CO2) вештачка цереброспинална течност со низок Ca2 + (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натриум фосфатен пуфер, 25 mM NaHCO3, 25 mM гликоза, 0,5 mM CaCl2 и 3,5 mM MgCl2 (осмотски притисок од 310 до 330 mmol). Добиените парчиња мозок префрлете ги во претинкубациска комора што содржи повисок Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натриум фосфатен пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и 2,0 mM MgCl2) Средина) pH 7,4 и 310 до 320 mmol).
За време на процесот на снимање, парчињата беа преместени во посебна просторија за снимање, а експериментот беше извршен под континуирана ACSF перфузија на константна температура од 32° до 33°C. За снимање на парчињата беше користен мултифотонски ласерски скенирачки микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) опремен со објектив од Leica 25x (NA 0.95, вода), Ti: Sapphire ласер (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM модул (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM на Grx1-roGFP2. Промените во цитоплазматската редокс состојба на PNs беа измерени со двофотонски FLIM во сагитални парчиња од мозокот, каде што биосензорот Grx1-roGFP2 ги таргетираше PNs. Во слојот PN, полето за аквизиција е избрано околу 50 до 80 μm под површината на парчето за да се осигури дека постои одржлив PN (т.е. отсуство на зрнеста структура или невронски морфолошки промени по должината на дендритите) и двојно позитивниот сензор roGFP2 и AAV кодираат shRNA PCx или нејзината контролна секвенца (секој ко-експресира mCherry). Соберете слики од еден стек со 2x дигитален зум [бранова должина на побудување: 890 nm; 512 nm 512 пиксели]. Детекција: внатрешен HyD, филтер група со флуоресцеин изотиоцијанат (FITC)] и просекување на сликата во рок од 2 до 3 минути се користат за да се осигури дека се собрани доволно фотони (вкупно 1000 фотони) за прилагодување на кривата. Чувствителноста на сондата Grx1-roGFP2 и верификацијата на FLIM условите беа извршени со следење на вредноста на животниот век на roGFP2 при додавање на егзогени 10 mM H2O2 во перфузискиот ACSF (за да се максимизира оксидацијата, што резултира со зголемен животен век), а потоа додавање на 2 mM дитиотреитол (го минимизира степенот на редукција, што резултира со намалување на животниот век) (Слика S8, D до G). Користете го софтверот FLIMfit 5.1.1 за да ги анализирате добиените резултати, прилагодете ја кривата на единечно експоненцијално распаѓање на целата слика на измерената IRF (функција на одговор на инструментот), а χ2 е приближно 1. За да се пресмета животниот век на еден PN, маската околу нервното тело беше рачно нацртана, а просечниот животен век во секоја маска беше користен за квантификација.
Анализа на митохондријален потенцијал. Откако акутниот дел беше инкубиран со 100 nM TMRM директно додаден во перфузираниот ACSF во тек на 30 минути, промените на митохондријалниот потенцијал на PN беа измерени со двофотонски микроскоп. TMRM снимањето беше извршено со возбудување на сондата на 920 nm и користење на внатрешен HyD (тетраметилродамин изотиоцијанат: 585/40 nm) за собирање сигнали; со користење на истата бранова должина на возбудување, но користење на различен внатрешен HyD (FITC: 525/50) за снимање на mtYFP. Користете го додатокот Image Calculator на ImageJ за да го процените митохондријалниот потенцијал на ниво на единечна клетка. Накратко, равенката на приклучокот: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) се користи за да се идентификува митохондријалниот регион што го прикажува TMRM сигналот во Пуркиниева сомалиска азбука во едностек конфокалната слика на соодветниот канал. Потоа, површината на пикселите во добиената маска се квантифицира, а потоа се нормализира на соодветната прагова едностек слика на mtYFP каналот за да се добие митохондријалната фракција што го покажува митохондријалниот потенцијал.
Сликата беше деконволутирана со софтверот Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). За скенираните слики од плочки, монтажата на една плочка е направена со помош на алгоритмот за автоматско шиење што го обезбедува софтверот LAS-X. По калибрацијата на сликата, користете ImageJ и Adobe Photoshop за понатамошна обработка на сликата и рамномерно прилагодување на осветленоста и контрастот. Користете Adobe Illustrator за графичка подготовка.
Анализа на фокус на mtDNA. Бројот на лезии на mtDNA беше квантифициран на церебеларни пресеци обележани со антитела против ДНК со конфокален микроскоп. Секоја целна област беше креирана за клеточното тело и јадрото на секоја клетка, а соодветната област беше пресметана со помош на додатокот Multi Measure (софтвер ImageJ). Одземете ја нуклеарната површина од површината на клеточното тело за да ја добиете цитоплазматската површина. Конечно, додатокот Analyze Particles (софтвер ImageJ) беше користен за автоматско квантификување на цитоплазматските ДНК точки што укажуваат на mtDNA на прагот на сликата, а добиените резултати беа нормализирани на просекот на PN кај CTRL глувците. Резултатите се изразуваат како просечен број на нуклеозиди по клетка.
Анализа на експресија на протеини. Користете го додатокот Image Calculator на ImageJ за да ја процените експресијата на протеини во PN на ниво на една клетка. Накратко, во еднослојната конфокална слика на соодветниот канал, преку равенката: сигнал = мин (mtYFP, антитело), ​​се идентификува митохондријалниот регион што покажува имунореактивност на одредено антитело во Пуркина. Потоа, површината на пикселите во добиената маска се квантификува, а потоа се нормализира на соодветната праговна едностек слика на mtYFP каналот за да се добие митохондријалната фракција на прикажаниот протеин.
Анализа на густината на Пуркиниевите клетки. Додатокот Cell Counter на ImageJ беше користен за да се процени густината на Пуркиниевите клетки со делење на бројот на избројани Пуркиниеви клетки со должината на церебеларниот прстен што го зафаќаат избројаните клетки.
Подготовка и собирање примероци. Мозоците од контролната група и глувците Mfn2cKO беа фиксирани во 2% PFA/2,5% глутаралдехид во 0,1 M фосфатен пуфер (PB), а потоа короналните пресеци беа подготвени со употреба на цилијати (Leica Mikrosysteme GmbH, Виена, Австрија) (Дебелина од 50 до 60 μm). Потоа фиксирајте во PB пуфер во 1% os тетраоксид и 1,5% калиум фероцијанид на собна температура во тек на 1 час. Пресеците беа измиени три пати со дестилирана вода, а потоа обоени со 70% етанол што содржи 1% уранил ацетат во тек на 20 минути. Пресеците потоа беа дехидрирани во градуиран алкохол и вградени во епоксидна смола Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, каталошки број 14040) помеѓу стаклени плочки обложени со силикон, и конечно на 60°C полимеризирајте во рерна 48 часа. Беше избрана областа на церебеларниот кортекс и беа исечени ултратенки пресеци од 50 nm на Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Виена, Австрија) и извлечени на мрежа од бакарни процепи од 2×1 mm обложена со полистиренска фолија. Пресеците беа обоени со раствор од 4% уранил ацетат во H2O 10 минути, измиени со H2O неколку пати, потоа со оловен цитрат на Рејнолдс во H2O 10 минути, а потоа измиени со H2O неколку пати. Микрографиите беа направени со трансмисионен електронски микроскоп Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САД) со користење на дигитален фотоапарат TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, САД). Германија).
Кај глувци инфицирани со AAV, мозокот беше одвоен и исечен на сагитален пресек со дебелина од 1 mm, а малиот мозок беше испитан со флуоресцентен микроскоп за да се идентификува прстенот инфициран со AAV (т.е., кој експресира mCherry). Се користат само експерименти во кои инјекцијата на AAV резултира со многу висока ефикасност на трансдукција на слојот на Пуркиниевите клетки (т.е. речиси целиот слој) во најмалку два последователни церебеларни прстени. Јамката трансдуцирана со AAV беше микродисецирана за постфиксација преку ноќ (4% PFA и 2,5% глутаралдехид во 0,1 M кокоат пуфер) и понатаму обработена. За вградување на EPON, фиксираното ткиво беше измиено со 0,1 M натриум кокоат пуфер (Applichem) и инкубирано со 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) во 0,1 M натриум кокоат пуфер (Applichem) 4 часа, а потоа измиено 2 часа. Повторете 3 пати со 0,1 M кокамиден пуфер. Последователно, растечката серија на етанол беше употребена за инкубирање на секој раствор на етанол на 4°C во тек на 15 минути за да се дехидрира ткивото. Ткивото беше префрлено во пропилен оксид и инкубирано преку ноќ во EPON (Sigma-Aldrich) на 4°C. Ставете го ткивото во свеж EPON на собна температура 2 часа, а потоа вградете го на 62°C 72 часа. Користете ултрамикротом (Leica Microsystems, UC6) и дијамантски нож (Diatome, Biel, Швајцарија) за да исечете ултратенки делови од 70 nm и обојте ги со 1,5% уранил ацетат 15 минути на 37°C и обојте ги со раствор на оловен цитрат 4 минути. Електронските микрографии беа направени со помош на трансмисионен електронски микроскоп JEM-2100 Plus (JEOL) опремен со Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) и софтвер DigitalMicrograph (Gatan). За анализа, електронските микрографии беа направени со дигитален зум од 5000× или 10.000×.
Морфолошка анализа на митохондриите. За сите анализи, контурите на поединечните митохондрии беа рачно исцртани на дигитални слики со помош на софтверот ImageJ. Анализирани се различни морфолошки параметри. Митохондријалната густина се изразува како процент добиен со делење на вкупната митохондријална површина на секоја клетка со површината на цитоплазмата (површина на цитоплазмата = површина на клетката - површина на јадрото на клетката) × 100. Заобленоста на митохондриите се пресметува со формулата [4π∙(површина/периметар 2)]. Морфологијата на митохондриите беше анализирана и поделена во две категории („тубуларна“ и „меур“) според нивните главни форми.
Анализа на бројот и густината на автофагозомите/лизозомите. Користете го софтверот ImageJ за рачно да ги исцртате контурите на секој автофагозом/лизозом на дигиталната слика. Површината на автофагозомот/лизозомот се изразува како процент пресметан со делење на вкупната површина на структурата на автофагозомот/лизозомот на секоја клетка со површината на цитоплазмата (површина на цитоплазмата = површина на клетката - површина на јадрото) × 100. Густината на автофагозомите/лизозомите се пресметува со делење на вкупниот број со бројот на структури на автофагозомите/лизозомите по клетка (во однос на цитоплазматската површина) (цитоплазматска површина = површина на клетката - површина на јадрото).
Означување за акутно сечење и подготовка на примероци. За експерименти што бараат означување со гликоза, префрлете ги парчињата од акутниот мозок во комора за претходна инкубација, која содржи заситен јаглерод (95% O2 и 5% CO2), високо ниво на Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натриум фосфатен пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и 2,0 mM MgCl2, прилагодено на pH 7,4 и 310 до 320 mOsm), во која гликозата е 13C6- супституција на гликоза (Eurisotop, каталошки број CLM-1396). За експерименти што бараат обележување со пируват, префрлете ги акутните парчиња мозок во повисок Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натриум фосфатен пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и додадете 2,0 mM MgCl2, прилагодете на pH 7,4 и 310 до 320 mOsm), и додадете 1 mM 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталошки број CLM-1082). Инкубирајте ги парчињата 90 минути на 37°C. На крајот од експериментот, парчињата брзо се измиваат со воден раствор (pH 7,4) што содржи 75 mM амониум карбонат, а потоа се хомогенизираат во 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрил (ACN): метанол: вода. Откако деловите беа инкубирани на мраз 30 минути, примероците беа центрифугирани на 21.000 g 10 минути на 4°C, а бистрата супернатантна течност беше сушена во концентратор SpeedVac. Добиениот сушен пелет од метаболит беше складиран на -80°C до анализата.
Анализа со течна хроматографија-масена спектрометрија на 13 аминокиселини обележани со C. За анализа со течна хроматографија-масена спектрометрија (LC-MS), пелетот од метаболит беше ресуспендиран во 75 μl вода со LC-MS квалитет (Honeywell). По центрифугирање на 21.000 g во тек на 5 минути на 4°C, 20 μl од прочистениот супернатант беше искористен за анализа на флуксот на аминокиселини, додека остатокот од екстрактот веднаш беше искористен за анализа на анјони (видете подолу). Анализата на аминокиселини беше извршена со користење на претходно опишаниот протокол за дериватизација на бензоил хлорид (55, 56). Во првиот чекор, 10 μl од 100 mM натриум карбонат (Sigma-Aldrich) беше додаден во 20 μl екстракт од метаболит, а потоа 10 μl од 2% бензоил хлорид (Sigma-Aldrich) беше додаден во LC квалитет ACN. Примерокот беше кратко вртложен, а потоа центрифугиран на 21.000 g во тек на 5 минути на 20°C. Префрлете го прочистениот супернатант во шишенце за автосемплер од 2 ml со конусен стаклен влошок (волумен од 200 μl). Примероците беа анализирани со помош на ултра-високо-перформансниот LC систем Acquity iClass (Waters) поврзан со прецизниот масен спектрометар со висока резолуција Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). За анализа, 2 μl од дериватизираниот примерок беше инјектиран во колона од силициум диоксид T3 со висока цврстина од 100×1,0 mm (Waters) што содржи честички од 1,8 μm. Брзината на проток е 100 μl/min, а пуферскиот систем се состои од пуфер А (10 mM амониум формат и 0,15% мравја киселина во вода) и пуфер Б (ACN). Градиентот е како што следува: 0%B на 0 минути; 0%B. 0 до 15% Б на 0 до 0,1 минути; 15 до 17% Б на 0,1 до 0,5 минути; Б на 17 до 55% на 0,5 до 14 минути; Б на 55 до 70% на 14 до 14,5 минути; на 14,5 до 70 до 100% Б на 18 минути; 100% Б на 18 до 19 минути; 100 до 0% Б на 19 до 19,1 минути; 0% Б на 19,1 до 28 минути (55, 56). Масениот спектрометар QE-HF работи во режим на позитивна јонизација со опсег на маса од m/z (однос маса/полнеж) од 50 до 750. Применетата резолуција е 60.000, а добиената јонска цел за контрола на засилување (AGC) е 3×106, а максималното јонско време е 100 милисекунди. Загреаниот извор на електроспреј јонизација (ESI) работи со напон на прскање од 3,5 kV, капиларна температура од 250°C, проток на воздух во обвивката од 60 AU (произволни единици) и помошен проток на воздух од 20 AU. 250°C. S леќата е поставена на 60 AU.
Анјонска хроматографија-MS анализа на органски киселини обележани со 13C. Преостанатиот талог од метаболит (55 μl) беше анализиран со помош на систем за јонска хроматографија Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) поврзан со QE-HF масен спектрометар (Thermo Fisher Scientific). Накратко, 5 μl екстракт од метаболит беше инјектиран во колона Dionex IonPac AS11-HC опремена со HPLC (2 mm×250 mm, големина на честички 4 μm, Thermo Fisher Scientific) во режим на делумна јамка со притискање со сооднос на полнење од 1. ) Dionex IonPac AG11-HC заштитна колона (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Температурата на колоната се одржува на 30°C, а автосемплерот е поставен на 6°C. Користете кертриџ од калиум хидроксид обезбеден со дејонизирана вода за да генерирате градиент на калиум хидроксид преку генераторот на елуент. Одвојување на метаболити со брзина на проток од 380 μl/min, со примена на следниот градиент: 0 до 3 минути, 10 mM KOH; 3 до 12 минути, 10 до 50 mM KOH; 12 до 19 минути, 50 до 100 mM KOH; 19 до 21 минута, 100 mM KOH; 21 до 21,5 минути, 100 до 10 mM KOH. Колоната беше повторно изедначена под 10 mM KOH во тек на 8,5 минути.
Елуираните метаболити се комбинираат со додатен тек на изопропанол од 150 μl/min по колоната, а потоа се насочуваат кон масен спектрометр со висока резолуција кој работи во режим на негативна јонизација. MS го следи опсегот на маса од m/z 50 до 750 со резолуција од 60.000. AGC е поставен на 1×106, а максималното јонско време се одржува на 100 ms. Загреаниот ESI извор работеше со напон на прскање од 3,5 kV. Другите поставки на јонскиот извор се следниве: капиларна температура 275°C; проток на гас од обвивката, 60 AU; проток на помошен гас, 20 AU на 300°C и поставување на S леќата на 60 AU.
Анализа на податоци од метаболити обележани со 13C. Користете го софтверот TraceFinder (верзија 4.2, Thermo Fisher Scientific) за анализа на податоците за односот на изотопите. Идентитетот на секое соединение беше потврден со сигурно референтно соединение и независно анализиран. За да се изврши анализа на збогатување на изотопите, површината на екстрахираниот јонски хроматограм (XIC) на секој изотоп 13C (Mn) беше екстрахирана од [M + H]+, каде што n е јаглеродниот број на целното соединение, што се користи за анализа на аминокиселини или [MH]+ се користи за анализа на анјони. Точноста на масата на XIC е помала од пет делови на милион, а точноста на RT е 0,05 минути. Анализата на збогатување се изведува со пресметување на односот на секој детектиран изотоп кон збирот на сите изотопи на соодветното соединение. Овие односи се дадени како процентни вредности за секој изотоп, а резултатите се изразуваат како моларен процент на збогатување (MPE), како што е опишано претходно (42).
Замрзнатиот невронски пелет беше хомогенизиран во ледено ладен 80% метанол (v/v), измешан во вртежен момент и инкубиран на -20°C во тек на 30 минути. Повторно измешајте го примерокот во вртежен момент и промешајте на +4°C во тек на 30 минути. Примерокот беше центрифугиран на 21.000 g во тек на 5 минути на 4°C, а потоа добиениот супернатант беше собран и сушен со помош на концентратор SpeedVac на 25°C за последователна анализа. Како што е опишано погоре, LC-MS анализата беше извршена на аминокиселините на сортираните клетки. Користејќи TraceFinder (верзија 4.2, Thermo Fisher Scientific), анализата на податоците беше извршена со помош на моноизотопната маса на секое соединение. Квантилна нормализација на податоците за метаболитите беше извршена со помош на софтверскиот пакет preprocessCore (57).
Подготовка на парче. Глушецот беше брзо анестезиран со јаглерод диоксид и обезглавен, мозокот брзо беше отстранет од черепот, а вибрирачкиот нож исполнет со мраз (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германија) беше употребен за да се исече на сагитални пресеци од 300 до 375 μm. Гасификација со ладен јаглерод (95% O2 и 5% CO2). Ниско ниво на Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натриум фосфатен пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 1,0 mM CaCl2 и 6,0 mM MgCl2. Прилагодување на pH 7,4 и 310 до 330 mOsm). Добиените парчиња мозок префрлете ги во комора што содржи повисок Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM натриум фосфатен пуфер, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-глукоза, 4,0 mM CaCl2 и mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 и 310 до 320 mOsm). Чувајте ги парчињата 20 до 30 минути за да можат да се вратат пред снимањето.
снимање. За сите снимања беше користена микроскопска сцена опремена со фиксна комора за снимање и објектив со 20x потопување во вода (Scientifica). Претпоставените Пуркиниеви клетки беа идентификувани според (i) големината на телото, (ii) анатомската локација на малиот мозок и (iii) експресијата на флуоресцентниот mtYFP репортерски ген. Пипетата со отпор на врвот од 5 до 11 мегаоми е извлечена со боросиликатно стаклена капиларна фолија (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Германија) и хоризонтална пипета Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Сите снимања беа извршени од ELC-03XS npi засилувач со клешта (npi electronic GmbH, Tam, Германија), кој беше контролиран од софтверот Signal (верзија 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Велика Британија). Експериментот беше снимен со брзина на земање примероци од 12,5 kHz. Сигналот се филтрира со два краткотрајни Беселов филтри со гранични фреквенции од 1,3 и 10 kHz, соодветно. Капацитетот на мембраната и пипетата се компензира со компензациско коло со помош на засилувачот. Сите експерименти се извршени под контрола на камера Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Германија), која беше контролирана од софтверот Hokawo (верзија 2.8, Hamamatsu, Gerden, Германија).
Рутинска конфигурација и анализа на целата клетка. Непосредно пред снимањето, наполнете ја пипетата со внатрешниот раствор што ги содржи следниве супстанции: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM калиум глуконат, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM гванозин трифосфат (GTP) (Na) и 10,0 mM креатинин фосфат, pH вредноста беше прилагодена на 7,25, а осмотскиот притисок беше 290 mOsm (сахароза). Веднаш по примената на сила од 0 pA за руптура на мембраната, беше измерен мембранскиот потенцијал во мирување. Влезниот отпор се мери со примена на хиперполизирани струи од -40, -30, -20 и -10 pA. Измерете ја големината на напонскиот одговор и користете го Омовиот закон за да го пресметате влезниот отпор. Спонтаната активност беше снимена во напонска клешта во траење од 5 минути, а sPSC беше идентификуван и измерен во Igor Pro (верзија 32 7.01, WaveMetrics, Лејк Освего, Орегон, САД) со помош на полуавтоматска скрипта за препознавање. IV кривата и струјата во стационарна состојба се мерат со стегање на батеријата на различни потенцијали (почнувајќи од -110 mV) и зголемување на напонот во чекори од 5 mV. Производството на AP беше тестирано со примена на деполаризирачка струја. Стегнете ја ќелијата на -70 mV додека применувате импулс на деполаризирачка струја. Прилагодете ја големината на чекорот на секоја единица за снимање одделно (10 до 60 pA). Пресметајте ја максималната AP фреквенција со рачно броење на импулсните скокови што предизвикуваат највисока AP фреквенција. Прагот на AP се анализира со користење на вториот дериват на импулсот на деполаризација што прво активира еден или повеќе AP.
Конфигурација и анализа на перфорирана крпеница. Извршете снимање на перфорирана крпеница со користење на стандардни протоколи. Користете пипета без ATP и GTP која не ги содржи следниве состојки: 128 mM глуконат K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA и 2 mM MgCl2 и прилагодете ја на pH 7,2 (користејќи KOH). ATP и GTP се изоставени од интрацелуларниот раствор за да се спречи неконтролирана пропустливост на клеточната мембрана. Пипетата со крпеница е исполнета со внатрешен раствор што содржи амфотерицин (приближно 200 до 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) за да се добие запис за перфорирана крпеница. Амфотерицинот беше растворен во диметил сулфоксид (конечна концентрација: 0,1 до 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Концентрацијата на употребениот DMSO немаше значаен ефект врз проучуваните неврони. За време на процесот на дупчење, отпорот на каналот (Ra) беше континуирано следен, а експериментот започна откако амплитудата на Ra и AP се стабилизираа (20-40 минути). Спонтаната активност се мери во клешта за напон и/или струја во тек на 2 до 5 минути. Анализата на податоците е извршена со користење на Igor Pro (верзија 7.05.2, WaveMetrics, САД), Excel (верзија 2010, Microsoft Corporation, Редмонд, САД) и GraphPad Prism (верзија 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Со цел да се идентификуваат спонтани AP, се користи додатокот NeuroMatic v3.0c на IgorPro. Автоматски идентификувајте ги AP користејќи даден праг, кој се прилагодува индивидуално за секој запис. Користејќи го интервалот на шилци, одредете ја фреквенцијата на шилци со максимална моментална фреквенција на шилци и просечна фреквенција на шилци.
Изолација на PN. Со прилагодување на претходно објавениот протокол, PNs беше прочистен од малиот мозок на глушец во одредена фаза (58). Накратко, малиот мозок беше дисециран и исечкан во ледено ладен медиум за дисоцијација [без HBSS Ca2+ и Mg2+, дополнет со 20 mM гликоза, пеницилин (50 U/ml) и стрептомицин (0,05 mg/ml)], а потоа медиумот беше разграден во папаин [HBSS, дополнет со 1-цистеин·HCl (1 mg/ml), папаин (16 U/ml) и деоксирибонуклеаза I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Третирајте 30 минути на 30°C. Прво измијте ги ткивата во HBSS медиум што содржи слуз од јајце (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) и DNase (0,1 mg/ml) на собна температура за да се спречи ензимско варење, а потоа во HBSS медиум што содржи 20 mM гликоза. Нежно мелење во HBSS, пеницилин (50 U/ml), стрептомицин (0,05 mg/ml) и DNase (0,1 mg/ml) ослободува единечни клетки. Добиената клеточна суспензија беше филтрирана низ цедалка за клетки од 70 μm, потоа клетките беа пелетирани со центрифугирање (11-10 вртежи во минута, 5 минути, 4°C) и ресуспендирани во медиум за сортирање [HBSS, дополнет со 20 mM гликоза, 20% фетален говедски серум, пеницилин (50 U/ml) и стрептомицин (0,05 mg/ml)]; оценете ја одржливоста на клетките со пропидиум јодид и прилагодете ја густината на клетките на 1×106 до 2×106 клетки/ml. Пред проточната цитометрија, суспензијата беше филтрирана низ цедалка за клетки од 50 μm.
Проточен цитометар. Сортирањето на клетките беше извршено на 4°C со помош на машина FACSAria III (BD Biosciences) и софтвер FACSDiva (BD Biosciences, верзија 8.0.1). Суспензијата на клетките беше сортирана со помош на млазница од 100 μm под притисок од 20 psi со брзина од ~2800 настани/сек. Бидејќи традиционалните критериуми за затворање (големина на клетките, бимодална дискриминација и карактеристики на расејување) не можат да обезбедат правилна изолација на PN од други типови клетки, стратегијата за затворање е поставена врз основа на директна споредба на интензитетот на YFP и автофлуоресценцијата кај mitoYFP+ ​​​​и контролните mitoYFP − глувци. YFP се возбудува со озрачување на примерокот со ласерска линија од 488 nm, а сигналот се детектира со помош на филтер за пропусен опсег од 530/30 nm. Кај mitoYFP+ ​​​​глувците, релативната јачина на репортерскиот ген Rosa26-mitoYFP се користи и за разликување на фрагменти од невронски тела и аксони. 7-AAD е возбуден со жолт ласер од 561 nm и детектиран со филтер со опсег на пропустливост од 675/20 nm за да се исклучат мртвите клетки. За да се одделат астроцитите истовремено, клеточната суспензија беше обоена со ACSA-2-APC, потоа примерокот беше озрачен со ласерска линија од 640 nm, а за детекција на сигналот беше користен филтер со опсег на пропустливост од 660/20 nm.
Собраните клетки беа пелетирани со центрифугирање (1110 вртежи во минута, 5 минути, 4°C) и складирани на -80°C до употреба. Глувците Mfn2cKO и нивните младенчиња од легло се класифицираат истиот ден за да се минимизира варијабилноста на постапката. Презентацијата и анализата на FACS податоците беа извршени со користење на софтверот FlowJo (FlowJo LLC, Ашланд, Орегон, САД).
Како што е споменато погоре (59), PCR во реално време се користи за изолирање на ДНК од сортираните неврони за последователна квантификација на mtDNA. Линеарноста и прагот на чувствителност првично беа тестирани со извршување на qPCR на различен број на клетки. Накратко, соберете 300 PN во пуфер за лиза кој се состои од 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 и протеиназа K (200 ng/ml) и инкубирајте на 55°C 120 минути. Клетките беа дополнително инкубирани на 95°C 10 минути за да се обезбеди целосна инактивација на протеиназа K. Користејќи TaqMan сонда (Thermo Fisher) специфична за mt-Nd1, mtDNA беше мерена со полуквантитативна PCR во системот 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, каталошки број Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталошки број AIVI3E8) и 18S (Thermo Fisher Scientific, каталошки број Hs99999901_s1) гени.
Подготовка на примерок од протеом. Со загревање на растворот на 95°C во тек на 10 минути и соникирање, во пуфер за лиза [6 M гванидин хлорид, 10 mM трис(2-карбоксиетил) фосфин хидрохлорид, 10 mM хлорацетамид и 100 mM трис-Лиз замрзнати невронски пелети во HCl]. На Bioruptor (Diagenode) во тек на 10 минути (30 секунди пулсирање / 30 секунди пауза). Примерокот беше разреден 1:10 во 20 mM трис-HCl (pH 8,0), измешан со 300 ng трипсин злато (Promega) и инкубиран преку ноќ на 37°C за да се постигне целосно варење. Вториот ден, примерокот беше центрифугиран на 20.000 g во тек на 20 минути. Супернатантот беше разреден со 0,1% мравја киселина, а растворот беше десален со самопроизведени StageTips. Примерокот беше сушен во инструмент SpeedVac (Eppendorf концентратор плус 5305) на 45°C, а потоа пептидот беше суспендиран во 0,1% мравја киселина. Сите примероци беа подготвени истовремено од истото лице. За да се анализираат примероците од астроцити, 4 μg десалирани пептиди беа обележани со тандемска ознака за маса (TMT10plex, каталошки број 90110, Thermo Fisher Scientific) со однос пептид и TMT реагенс од 1:20. За TMT обележување, 0,8 mg TMT реагенс беше ресуспендиран во 70 μl безводен ACN, а исушениот пептид беше реконституиран во 9 μl 0,1 M TEAB (триетиламониум бикарбонат), на кој беа додадени 7 μl TMT реагенс во ACN. Концентрацијата беше 43,75%. По 60 минути инкубација, реакцијата беше угасната со 2 μl 5% хидроксиламин. Обележаните пептиди беа собрани, сушени, ресуспендирани во 200 μl 0,1% мравја киселина (FA), поделени на два дела, а потоа десалитирани со помош на самоизработени StageTips. Користејќи ултра високо-перформансен течен хроматограф UltiMate 3000 (ултра високо-перформансен течен хроматограф UltiMate 3000), едната од двете половини беше фракционирана на хроматографска колона Acquity од 1 mm x 150 mm исполнета со честички C18 од 130 Å1,7 μm (Waters, каталошки број SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Одделете ги пептидите со брзина на проток од 30 μl/min, одвојте од 1% до 50% пуфер Б 85 минути со постепен градиент од 96 минути, од 50% до 95% пуфер Б 3 минути, потоа 8 минути за 95% пуфер Б; Пуферот А е 5% ACN и 10 mM амониум бикарбонат (ABC), а пуферот Б е 80% ACN и 10 mM ABC. Собирајте ги фракциите на секои 3 минути и комбинирајте ги во две групи (1 + 17, 2 + 18, итн.) и исушете ги во вакуумска центрифуга.
LC-MS/MS анализа. За масена спектрометрија, пептидите (број r119.aq) беа одвоени на аналитичка колона PicoFrit од 25 cm и внатрешен дијаметар од 75 μm (нова објективна леќа, број на дел PF7508250) опремена со медиум ReproSil-Pur 120 C18-AQ од 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), користејќи EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Германија). Колоната се одржуваше на 50°C. Баферите А и Б се 0,1% мравја киселина во вода и 0,1% мравја киселина во 80% ACN, соодветно. Пептидите беа одвоени од 6% до 31% пуфер Б за 65 минути и од 31% до 50% пуфер Б за 5 минути со градиент од 200 nl/мин. Елуираните пептиди беа анализирани на масен спектрометар Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Мерењето на m/z вредноста на пептидниот прекурсор е извршено со резолуција од 120.000 во опсег од 350 до 1500 m/z. Користејќи 27% нормализирана енергија на судир, најсилниот прекурсор со состојба на полнење од 2 до 6 е избран за расцепување на дисоцијација на стапица со висока енергија (HCD). Времето на циклусот е поставено на 1 s. Вредноста m/z на пептидниот фрагмент е измерена во јонската стапица користејќи ја најмалата AGC цел од 5×104 и максималното време на инјектирање од 86 ms. По фрагментацијата, прекурсорот е ставен на листата за динамичко исклучување за 45 s. Пептидите обележани со TMT беа одделени на колона Acclaim PepMap од 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, каталошки број 164942), а миграциските спектри беа анализирани на масен спектрометар Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) опремен со опрема за асиметрични бранови форми на високо поле (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) која работи на два компензациски напони од -50 и -70 V. MS3 избран врз основа на прекурсорот за синхронизација се користи за мерење на сигналот на јонскиот извештај на TMT. Одвојувањето на пептидите беше извршено на EASY-nLC 1200, користејќи 90% линеарно градиентно елуирање, со концентрација на пуфер од 6% до 31%; пуферот А беше 0,1% FA, а пуферот Б беше 0,1% FA и 80% ACN. Аналитичката колона работи на 50°C. Користете FreeStyle (верзија 1.6, Thermo Fisher Scientific) за да ја поделите оригиналната датотека според компензацискиот напон на FAIMS.
Идентификација и квантификација на протеини. Користејќи го интегрираниот пребарувач Andromeda, оригиналните податоци беа анализирани со користење на MaxQuant верзија 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Покрај секвенците на Cre рекомбиназа и YFP добиени од Aequorea victoria, беа пребарувани спектри на пептидни фрагменти за каноничната секвенца и изоформската секвенца на референтниот протеом на глушецот (Proteome ID UP000000589, преземен од UniProt во мај 2017 година). Оксидацијата на метионин и N-терминалната ацетилација на протеинот беа поставени како променливи модификации; метилацијата на цистеин карбамоил беше поставена како фиксни модификации. Параметрите за варење се поставени на „специфичност“ и „трипсин/P“. Минималниот број на пептиди и жилет пептиди што се користат за идентификација на протеини е 1; минималниот број на уникатни пептиди е 0. Под услови на совпаѓање на пептидната мапа, стапката на идентификација на протеините беше 0,01. Опцијата „Втор пептид“ е овозможена. Користете ја опцијата „совпаѓање помеѓу извршувања“ за пренос на успешни идентификации помеѓу различни оригинални датотеки. Користете го минималниот сооднос на LFQ број 1 за квантификација без етикета (LFQ) (60). Интензитетот на LFQ се филтрира за најмалку две валидни вредности во најмалку една генотипска група во секоја временска точка и се екстраполира од нормална распределба со ширина од 0,3 и се движи надолу за 1,8. Користете ја компјутерската платформа Perseus (https://maxquant.net/perseus/) и R (https://r-project.org/) за да ги анализирате резултатите од LFQ. Двонасочен умерен t-тест од софтверскиот пакет limma беше користен за анализа на диференцијална експресија (61). Експлораторната анализа на податоци се изведува со користење на ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally и pheatmap. Податоците за протеомика базирани на TMT беа анализирани со користење на MaxQuant верзија 1.6.10.43. Пребарајте сурови протеомски податоци од базата на податоци за човечка протеомика на UniProt, која беше преземена во септември 2018 година. Анализата го вклучува факторот за корекција на чистотата на изотопите обезбеден од производителот. Користете limma во R за анализа на диференцијална експресија. Оригиналните податоци, резултатите од пребарувањето на базата на податоци и работниот тек и резултатите од анализата на податоците се складирани во алијансата ProteomeXchange преку партнерското складиште PRIDE со идентификатор на збир на податоци PXD019690.
Функционалните анотации ја збогатуваат анализата. Алатката Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) беше користена за да се утврди богатството на термините за функционална анотација на збирот податоци на 8 недели (Слика 1). Накратко, квантитативната листа на протеини добиена од анализата на податоци LC-MS/MS (тандем масена спектрометрија) е користена со следните критериуми за филтрирање: Mus musculus е избран како вид и позадина, а категоријата покажува дека P вредноста прилагодена од Benjamini за збогатување 0,05 или пониска се смета за значајна. За овој графикон, прикажани се петте најголеми категории на вишок во секој кластер врз основа на прилагодената P вредност. Користејќи повеќекратен t-тест, користејќи ја двостепената линеарна програма за зголемување на Бенџамини, Кригер и Јекутиели (Q = 5%), анализата на експресијата на протеините со временски тек се изведува на важните кандидати идентификувани во секоја категорија, а секој ред се анализира одделно. Нема потреба да се усвојува конзистентен SD.
За да ги споредиме резултатите од ова истражување со објавените бази на податоци и да генерираме Вен-дијаграм на Слика 1, ја комбиниравме квантитативниот список на протеини со анотациите на MitoCarta 2.0 (24). За да го генерираме дијаграмот, ја користевме онлајн алатката Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
За детални информации за статистичките процедури што се користат за протеомска анализа, ве молиме погледнете го соодветниот дел од Материјали и методи. За сите други експерименти, детални информации може да се најдат во соодветната легенда. Освен ако не е поинаку наведено, сите податоци се изразени како средна вредност ± SEM, а сите статистички анализи се извршени со користење на софтверот GraphPad Prism 8.1.2.
За дополнителни материјали за овој напис, видете http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ова е статија со отворен пристап дистрибуирана според условите на лиценцата „Криејтив комонс“ - Наведи извор - Некомерцијално, која дозволува употреба, дистрибуција и репродукција во кој било медиум, сè додека конечната употреба не е за комерцијална добивка и премисата е дека оригиналното дело е точно. Референца.
Забелешка: Ве молиме само да ја наведете вашата е-адреса за лицето што го препорачувате на страницата да знае дека сакате да ја види е-поштата и дека не е спам. Нема да ги снимиме е-адресите.
Ова прашање се користи за да се провери дали сте посетител и да се спречи автоматско поднесување на спам.
Од Е. Мотори, И. Атанасов, СМВ Кочан, К. Фолц-Донахуе, В. Сактивелу, П. Џавалиско, Н. Тони, Ј. Пујал, Н.-Г. Ларсон
Протеомската анализа на нефункционалните неврони покажа дека метаболичките програми се активираат за да се спротивстават на невродегенерацијата.
Од Е. Мотори, И. Атанасов, СМВ Кочан, К. Фолц-Донахуе, В. Сактивелу, П. Џавалиско, Н. Тони, Ј. Пујал, Н.-Г. Ларсон
Протеомската анализа на нефункционалните неврони покажа дека метаболичките програми се активираат за да се спротивстават на невродегенерацијата.
©2020 Американско здружение за унапредување на науката. сите права се задржани. AAAS е партнер на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.