Статијата е дел од истражувачката тема „Напредни технологии за биоремедијација и процеси на рециклирање на синтетички органски соединенија (SOC). Погледнете ги сите 14 статии
Полицикличните ароматични јаглеводороди (PAH) со ниска молекуларна тежина, како што се нафталинот и супституираните нафталени (метилнафтален, нафтоева киселина, 1-нафтил-N-метилкарбамат, итн.) се широко користени во различни индустрии и се генотоксични, мутагени и/или канцерогени за организмите. Овие синтетички органски соединенија (SOC) или ксенобиотици се сметаат за приоритетни загадувачи и претставуваат сериозна закана за глобалната животна средина и јавното здравје. Интензитетот на човековите активности (на пр. гасификација на јаглен, рафинирање на нафта, емисии од возила и земјоделски апликации) ја одредува концентрацијата, судбината и транспортот на овие сеприсутни и перзистентни соединенија. Покрај методите за физички и хемиски третман/отстранување, зелените и еколошки технологии како што е биоремедијацијата, кои користат микроорганизми способни целосно да ги разградат POC или да ги претворат во нетоксични нуспроизводи, се појавија како безбедна, економична и ветувачка алтернатива. Различни бактериски видови кои припаѓаат на филите Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia и Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus и Paenibacillus) и Actinobacteria (Rhodococcus и Arthrobacter) во микробиотата на почвата покажаа способност за разградување на разни органски соединенија. Метаболните студии, геномиката и метагеномската анализа ни помагаат да ја разбереме катаболната комплексност и разновидност присутни во овие едноставни форми на живот, што може понатаму да се примени за ефикасна биоразградливост. Долгорочното постоење на PAH резултираше со појава на нови фенотипови на разградување преку хоризонтален генски трансфер со употреба на генетски елементи како што се плазмиди, транспозони, бактериофаги, геномски острови и интегративни конјугативни елементи. Системската биологија и генетскиот инженеринг на специфични изолати или модел заедници (конзорциуми) можат да овозможат сеопфатна, брза и ефикасна биоремедијација на овие PAH преку синергистички ефекти. Во овој преглед, се фокусираме на различните метаболички патишта и разновидност, генетскиот состав и разновидност, како и на клеточните одговори/адаптации на нафталинот и бактериите што го разградуваат супституираниот нафталин. Ова ќе обезбеди еколошки информации за примена на терен и оптимизација на соеви за ефикасна биоремедијација.
Брзиот развој на индустриите (петрохемикалии, земјоделство, фармацевтски производи, текстилни бои, козметика итн.) придонесе за глобален економски просперитет и подобрен животен стандард. Овој експоненцијален развој резултираше со производство на голем број синтетички органски соединенија (SOC), кои се користат за производство на разни производи. Овие странски соединенија или SOC вклучуваат полициклични ароматични јаглеводороди (PAH), пестициди, хербициди, пластификатори, бои, фармацевтски производи, органофосфати, средства за забавување на пламенот, испарливи органски растворувачи итн. Тие се испуштаат во атмосферата, водните и копнените екосистеми каде што имаат повеќедимензионални влијанија, предизвикувајќи штетни ефекти врз различни биоформи преку промена на физичкохемиските својства и структурата на заедницата (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Многу ароматични загадувачи имаат силни и деструктивни влијанија врз многу недопрени екосистеми/жаришта на биодиверзитетот (на пр. корални гребени, арктички/антарктички ледени покривки, високи планински езера, седименти во длабоко море итн.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Неодамнешните геомикробиолошки студии покажаа дека таложењето на синтетичка органска материја (на пр. ароматични загадувачи) и нивните деривати на површините на вештачките структури (изградена средина) (на пр. места на културно наследство и споменици направени од гранит, камен, дрво и метал) ја забрзува нивната деградација (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Човечките активности можат да ја интензивираат и влошат биолошката деградација на спомениците и зградите преку загадување на воздухот и климатските промени (Liu et al. 2020). Овие органски загадувачи реагираат со водената пареа во атмосферата и се таложат на структурата, предизвикувајќи физичка и хемиска деградација на материјалот. Биодеградацијата е широко призната како непожелни промени во изгледот и својствата на материјалите предизвикани од живи организми кои влијаат на нивното зачувување (Pochon and Jaton, 1967). Понатамошното микробно дејство (метаболизам) на овие соединенија може да го намали структурниот интегритет, ефикасноста на зачувувањето и културната вредност (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Од друга страна, во некои случаи, се покажа дека микробната адаптација и одговорот на овие структури се корисни бидејќи тие формираат биофилмови и други заштитни кори кои ја намалуваат стапката на распаѓање/разградување (Martino, 2016). Затоа, развојот на ефективни долгорочни одржливи стратегии за зачувување на камени, метални и дрвени споменици бара темелно разбирање на клучните процеси вклучени во овој процес. Во споредба со природните процеси (геолошки процеси, шумски пожари, вулкански ерупции, растителни и бактериски реакции), човечките активности резултираат со ослободување на големи количини на полициклични ароматични јаглеводороди (PAHs) и друг органски јаглерод (OC) во екосистемите. Многу PAH што се користат во земјоделството (инсектициди и пестициди како што се DDT, атразин, карбарил, пентахлорофенол, итн.), индустријата (сурова нафта, нафтен талог/отпад, пластика добиена од нафта, ПХБ, пластификатори, детергенти, средства за дезинфекција, фумиганти, мириси и конзерванси), производи за лична нега (креми за сончање, средства за дезинфекција, средства против инсекти и полициклични мошуси) и муниција (експлозиви како што е 2,4,6-TNT) се потенцијални ксенобиотици што можат да влијаат врз планетарното здравје (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Оваа листа може да се прошири за да вклучи соединенија добиени од нафта (горивни масла, лубриканти, асфалтени), биопластика со висока молекуларна тежина и јонски течности (Amde et al., 2015). Табела 1 ги наведува различните ароматични загадувачи и нивните примени во различни индустрии. Во последниве години, антропогените емисии на испарливи органски соединенија, како и јаглерод диоксид и други стакленички гасови, почнаа да се зголемуваат (Dvorak et al., 2017). Сепак, антропогените влијанија значително ги надминуваат природните. Покрај тоа, откривме дека голем број на SOC опстојуваат во многу еколошки средини и се идентификувани како нови загадувачи со негативни ефекти врз биомите (Слика 1). Агенциите за животна средина, како што е Агенцијата за заштита на животната средина на Соединетите Американски Држави (USEPA), вклучија многу од овие загадувачи на нивната листа на приоритети поради нивните цитотоксични, генотоксични, мутагени и канцерогени својства. Затоа, потребни се строги прописи за отстранување и ефикасни стратегии за третман/отстранување на отпад од контаминирани екосистеми. Различни физички и хемиски методи на третман, како што се пиролиза, оксидативен термички третман, воздушна аерација, депонирање, согорување итн. се неефикасни и скапи и генерираат корозивни, токсични и тешки за третман нуспроизводи. Со зголемувањето на глобалната еколошка свест, микроорганизмите способни да ги разградат овие загадувачи и нивните деривати (како што се халогенирани, нитро, алкил и/или метил) привлекуваат сè поголемо внимание (Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Употребата на овие автохтони кандидат микроорганизми сами или во мешани култури (колонии) за отстранување на ароматични загадувачи има предности во однос на безбедноста на животната средина, цената, ефикасноста, ефективноста и одржливоста. Истражувачите исто така ја истражуваат интеграцијата на микробните процеси со електрохемиски редокс методи, имено биоелектрохемиски системи (BES), како ветувачка технологија за третман/отстранување на загадувачи (Huang et al., 2011). BES технологијата привлекува сè поголемо внимание поради нејзината висока ефикасност, ниска цена, безбедност на животната средина, работа на собна температура, биокомпатибилни материјали и способност за обновување на вредни нуспроизводи (на пр., електрична енергија, гориво и хемикалии) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Појавата на алатки/методи за секвенционирање на геном со висок проток и омика обезбеди богатство од нови информации за генетската регулација, протеомика и флуксомика на реакциите на различни микроорганизми-деградатори. Комбинирањето на овие алатки со системската биологија дополнително го подобри нашето разбирање за селекцијата и финото подесување на целните катаболни патишта кај микроорганизмите (т.е. метаболички дизајн) за да се постигне ефикасна и ефективна биодеградација. За да дизајнираме ефикасни стратегии за биоремедијација со користење на соодветни кандидат микроорганизми, треба да го разбереме биохемискиот потенцијал, метаболичката разновидност, генетскиот состав и екологијата (автоекологија/синекологија) на микроорганизмите.
Сл. 1. Извори и патишта на нискомолекуларни PAHs низ различни еколошки средини и различни фактори што влијаат на биотата. Испрекинатите линии ги претставуваат интеракциите помеѓу елементите на екосистемот.
Во овој преглед, се обидовме да ги сумираме податоците за разградување на едноставни PAHs како што се нафталин и супституирани нафталини од страна на различни бактериски изолати кои опфаќаат метаболички патишта и разновидност, ензими вклучени во разградувањето, состав/содржина на гени и разновидност, клеточни одговори и различни аспекти на биоремедијацијата. Разбирањето на биохемиските и молекуларните нивоа ќе помогне во идентификувањето на соодветни соеви домаќини и нивното понатамошно генетско инженерство за ефикасна биоремедијација на вакви приоритетни загадувачи. Ова ќе помогне во развојот на стратегии за воспоставување на специфични бактериски конзорциуми за локацијата за ефикасна биоремедијација.
Присуството на голем број токсични и опасни ароматични соединенија (што го задоволува Хакеловото правило 4n + 2π електрони, n = 1, 2, 3, …) претставува сериозна закана за различни медиуми во животната средина како што се воздухот, почвата, седиментите и површинските и подземните води (Puglisi et al., 2007). Овие соединенија имаат единечни бензенски прстени (моноциклични) или повеќекратни бензенски прстени (полициклични) распоредени во линеарна, аголна или кластерска форма и покажуваат стабилност (стабилност/нестабилност) во животната средина поради висока негативна резонантна енергија и инертност (инертност), што може да се објасни со нивната хидрофобност и редуцирана состојба. Кога ароматичниот прстен дополнително се заменува со метил (-CH3), карбоксил (-COOH), хидроксил (-OH) или сулфонатни (-HSO3) групи, тој станува постабилен, има посилен афинитет кон макромолекули и е биоакумулативен во биолошките системи (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Некои полициклични ароматични јаглеводороди со ниска молекуларна тежина (LMWAH), како што се нафталинот и неговите деривати [метилнафтален, нафтоева киселина, нафталенсулфонат и 1-нафтил N-метилкарбамат (карбарил)], се вклучени во списокот на приоритетни органски загадувачи од страна на Агенцијата за заштита на животната средина на САД како генотоксични, мутагени и/или канцерогени (Cerniglia, 1984). Ослободувањето на оваа класа на NM-PAH во животната средина може да резултира со биоакумулација на овие соединенија на сите нивоа од синџирот на исхрана, со што влијае на здравјето на екосистемите (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Изворите и патиштата на PAH до биотата се првенствено преку миграција и интеракции помеѓу различни компоненти на екосистемот, како што се почвата, подземните води, површинските води, земјоделските култури и атмосферата (Arey and Atkinson, 2003). Слика 1 ги прикажува интеракциите и дистрибуцијата на различни PAH со ниска молекуларна тежина во екосистемите и нивните патишта до биотата/човечката изложеност. PAH се таложат на површините како резултат на загадувањето на воздухот и преку миграцијата (лебдењето) на емисиите од возилата, индустриските издувни гасови (гасификација на јаглен, согорување и производство на кокс) и нивното таложење. Индустриските активности како што се производството на синтетички текстил, бои и лакови; зачувувањето на дрвото; преработката на гума; активностите за производство на цемент; производството на пестициди; и земјоделските апликации се главни извори на PAH во копнените и водните системи (Bamforth and Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Студиите покажаа дека почвите во приградските и урбаните средини, во близина на автопатите и во големите градови се поподложни на полициклични ароматични јаглеводороди (PAH) поради емисиите од електраните, греењето на станбените објекти, оптоварувањето со воздушен и патен сообраќај и градежните активности (Suman et al., 2016). (2008) покажаа дека PAH во почвата во близина на патиштата во Њу Орлеанс, Луизијана, САД се високи и до 7189 μg/kg, додека на отворен простор, тие се само 2404 μg/kg. Слично на тоа, нивоата на PAH високи и до 300 μg/kg се пријавени во области во близина на местата за гасификација на јаглен во неколку градови во САД (Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005). Почвите од различни индиски градови како што се Делхи (Sharma et al., 2008), Агра (Dubey et al., 2014), Мумбаи (Kulkarni and Venkataraman, 2000) и Висакапатнам (Kulkarni et al., 2014) содржат високи концентрации на PAHs. Ароматичните соединенија полесно се адсорбираат на честичките од почвата, органската материја и глинените минерали, со што стануваат главни јаглеродни апсорбери во екосистемите (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Главните извори на PAHs во водните екосистеми се врнежите (влажни/суви врнежи и водена пареа), урбаните истечни води, испуштањето на отпадни води, полнењето на подземните води итн. (Srogi, 2007). Се проценува дека околу 80% од PAHs во морските екосистеми се добиваат од врнежи, седиментација и испуштање отпад (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Повисоките концентрации на PAHs во површинските води или исцедокот од местата за отстранување на цврст отпад на крајот се истекуваат во подземните води, што претставува голема закана за јавното здравје, бидејќи повеќе од 70% од населението во Јужна и Југоисточна Азија пие подземни води (Duttagupta et al., 2019). Неодамнешна студија на Duttagupta et al. (2020) за анализи на реки (32) и подземни води (235) од Западен Бенгал, Индија, покажа дека околу 53% од жителите на градовите и 44% од жителите на руралните средини (вкупно 20 милиони жители) може да бидат изложени на нафталин (4,9–10,6 μg/L) и неговите деривати. Различните модели на користење на земјиштето и зголемената екстракција на подземните води се сметаат за главни фактори што го контролираат вертикалниот транспорт (адвекција) на PAHs со ниска молекуларна тежина во подземјето. Утврдено е дека земјоделските истечни води, испуштањата на комунални и индустриски отпадни води и испуштањата на цврст отпад/ѓубре се под влијание на PAHs во речните сливови и подземните седименти. Атмосферските врнежи дополнително го влошуваат загадувањето со PAHs. Високи концентрации на PAH и нивните алкил деривати (вкупно 51) се пријавени во реки/сливови низ целиот свет, како што се реката Фрејзер, реката Луан, реката Денсо, реката Мисури, реката Анакостија, реката Ебро и реката Делавер (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Во седиментите на сливот на реката Ганг, нафталинот и фенантренот се покажаа како најзначајни (откриени во 70% од примероците) (Duttagupta et al., 2019). Покрај тоа, студиите покажаа дека хлорирањето на водата за пиење може да доведе до формирање на потоксични оксигенирани и хлорирани PAH (Manoli and Samara, 1999). PAH се акумулираат во житарките, овошјето и зеленчукот како резултат на апсорпцијата од страна на растенијата од контаминирани почви, подземни води и врнежи (Fismes et al., 2002). Многу водни организми како што се риби, школки, школки и ракчиња се контаминирани со PAH преку консумирање на контаминирана храна и морска вода, како и преку ткива и кожа (Mackay and Fraser, 2000). Методите на готвење/преработка како што се печење на скара, печење, чадење, пржење, сушење, печење и готвење на јаглен, исто така, можат да доведат до значителни количини на PAH во храната. Ова во голема мера зависи од изборот на материјал за чадење, содржината на фенолни/ароматични јаглеводороди, постапката на готвење, типот на грејач, содржината на влага, снабдувањето со кислород и температурата на согорување (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Полициклични ароматични јаглеводороди (PAH) се откриени и во млекото во различни концентрации (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Акумулацијата на овие PAH во храната зависи и од физичко-хемиските својства на храната, додека нивните токсични ефекти се поврзани со физиолошките функции, метаболичката активност, апсорпцијата, дистрибуцијата и дистрибуцијата во телото (Mechini et al., 2011).
Токсичноста и штетните ефекти на полицикличните ароматични јаглеводороди (PAH) се познати долго време (Cherniglia, 1984). Полицикличните ароматични јаглеводороди со мала молекуларна тежина (LMW-PAH) (два до три прстени) можат ковалентно да се врзат за разни макромолекули како што се ДНК, РНК и протеини и се канцерогени (Santarelli et al., 2008). Поради нивната хидрофобна природа, тие се одделени со липидни мембрани. Кај луѓето, цитохром P450 монооксигеназите ги оксидираат PAH во епоксиди, од кои некои се многу реактивни (на пр., баедиол епоксид) и можат да доведат до трансформација на нормалните клетки во малигни (Marston et al., 2001). Покрај тоа, производите на трансформација на PAH како што се хинони, феноли, епоксиди, диоли итн. се потоксични од матичните соединенија. Некои PAH и нивните метаболички меѓупроизводи можат да влијаат на хормоните и разните ензими во метаболизмот, со што негативно влијаат на растот, централниот нервен систем, репродуктивниот и имунолошкиот систем (Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Пријавено е дека краткорочната изложеност на PAH со ниска молекуларна тежина предизвикува нарушена функција на белите дробови и тромбоза кај астматичари и го зголемува ризикот од рак на кожата, белите дробови, мочниот меур и гастроинтестиналниот тракт (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Студиите врз животни, исто така, покажаа дека изложеноста на PAH може да има негативни ефекти врз репродуктивната функција и развој и може да предизвика катаракта, оштетување на бубрезите и црниот дроб и жолтица. Различни производи на биотрансформација на PAH, како што се диоли, епоксиди, хинони и слободни радикали (катјони), формираат ДНК аддукти. Докажано е дека стабилните адукти ја менуваат машинеријата за репликација на ДНК, додека нестабилните адукти можат да ја депуринираат ДНК (главно во аденин, а понекогаш и во гванин); и двата можат да генерираат грешки што водат до мутации (Schweigert et al. 2001). Дополнително, хиноните (бензо-/пан-) можат да генерираат реактивни кислородни видови (ROS), предизвикувајќи фатално оштетување на ДНК и други макромолекули, со што влијаат на функцијата/одржливоста на ткивата (Ewa and Danuta 2017). Пријавено е дека хроничната изложеност на ниски концентрации на пирен, бифенил и нафталин предизвикува рак кај експериментални животни (Diggs et al. 2012). Поради нивната смртоносна токсичност, чистењето/отстранувањето на овие PAH од засегнатите/контаминираните места е приоритет.
Различни физички и хемиски методи се користат за отстранување на PAH од контаминирани места/средини. Процеси како што се согорување, дехлорирање, UV оксидација, фиксација и екстракција со растворувач имаат многу недостатоци, вклучувајќи формирање на токсични нуспроизводи, сложеност на процесот, безбедносни и регулаторни проблеми, ниска ефикасност и висока цена. Сепак, микробната биодеградација (наречена биоремедијација) е ветувачки алтернативен пристап што вклучува употреба на микроорганизми во форма на чисти култури или колонии. Во споредба со физичките и хемиските методи, овој процес е еколошки, неинвазивен, економичен и одржлив. Биоремедијацијата може да се спроведе на засегнатото место (in situ) или на специјално подготвено место (ex situ) и затоа се смета за поодржлив метод на санација од традиционалните физички и хемиски методи (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Разбирањето на микробните метаболички чекори вклучени во деградацијата на ароматичните загадувачи има огромни научни и економски импликации за еколошката и еколошката одржливост. Се проценува дека 2,1×1018 грама јаглерод (C) се складира во седименти и органски соединенија (т.е. нафта, природен гас и јаглен, т.е. фосилни горива) низ целиот свет, што значителен придонес во глобалниот јаглероден циклус. Сепак, брзата индустријализација, екстракцијата на фосилни горива и човековите активности ги осиромашуваат овие литосферски резервоари на јаглерод, ослободувајќи околу 5,5×1015 g органски јаглерод (како загадувачи) во атмосферата годишно (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Поголемиот дел од овој органски јаглерод влегува во копнените и морските екосистеми преку седиментација, транспорт и истекување. Покрај тоа, новите синтетички загадувачи добиени од фосилни горива, како што се пластика, пластификатори и пластични стабилизатори (фталати и нивните изомери), сериозно ги загадуваат морските, почвените и водните екосистеми и нивната биота, со што ги влошуваат глобалните климатски ризици. Различни видови микропластика, нанопластика, пластични фрагменти и нивните токсични мономерни производи добиени од полиетилен терефталат (ПЕТ) се акумулирале во Тихиот Океан помеѓу Северна Америка и Југоисточна Азија, формирајќи ја „Големата пацифичка ѓубрена дамка“, штетејќи му на морскиот живот (Newell et al., 2020). Научните студии докажаа дека не е можно да се отстранат ваквите загадувачи/отпад со никакви физички или хемиски методи. Во овој контекст, најкорисните микроорганизми се оние способни оксидативно да ги метаболизираат загадувачите во јаглерод диоксид, хемиска енергија и други нетоксични нуспроизводи кои на крајот влегуваат во други процеси на циклус на хранливи материи (H, O, N, S, P, Fe, итн.). Така, разбирањето на микробната екофизиологија на минерализацијата на ароматични загадувачи и нејзината контрола на животната средина е клучно за проценка на микробниот јаглероден циклус, нето јаглеродниот буџет и идните климатски ризици. Со оглед на итната потреба за отстранување на ваквите соединенија од животната средина, се појавија различни екоиндустрии фокусирани на чисти технологии. Алтернативно, валоризацијата на индустрискиот отпад/отпадните хемикалии акумулирани во екосистемите (т.е. пристапот „од отпад до богатство“) се смета за еден од столбовите на целите за циркуларна економија и одржлив развој (Close et al., 2012). Затоа, разбирањето на метаболичките, ензимските и генетските аспекти на овие потенцијални кандидати за деградација е од најголема важност за ефикасно отстранување и биосанација на ваквите ароматични загадувачи.
Меѓу многуте ароматични загадувачи, посебно внимание обрнуваме на PAH со ниска молекуларна тежина како што се нафталинот и супституираните нафталени. Овие соединенија се главни компоненти на горивата добиени од нафта, текстилните бои, производите за широка потрошувачка, пестицидите (нафталици и средства против инсекти), пластификаторите и танините и затоа се широко распространети во многу екосистеми (Preuss et al., 2003). Неодамнешните извештаи истакнуваат акумулација на концентрации на нафтален во седиментите на водоносни слоеви, подземните води и подземните почви, вадозните зони и речните корита, што укажува на негова биоакумулација во животната средина (Duttagupta et al., 2019, 2020). Табела 2 ги сумира физичко-хемиските својства, примените и здравствените ефекти на нафталинот и неговите деривати. Во споредба со другите PAH со висока молекуларна тежина, нафталинот и неговите деривати се помалку хидрофобни, повеќе растворливи во вода и широко распространети во екосистемите, па затоа често се користат како моделни супстрати за проучување на метаболизмот, генетиката и метаболичката разновидност на PAH. Голем број микроорганизми се способни да го метаболизираат нафталинот и неговите деривати, а достапни се сеопфатни информации за нивните метаболички патишта, ензими и регулаторни карактеристики (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Покрај тоа, нафталинот и неговите деривати се означени како прототип соединенија за проценка на загадувањето на животната средина поради нивната голема застапеност и биорасположивост. Агенцијата за заштита на животната средина на САД проценува дека просечните нивоа на нафталин се 5,19 μg на кубен метар од чад од цигари, првенствено од нецелосно согорување, и 7,8 до 46 μg од чад од страничен тек, додека изложеноста на креозот и нафталин е од 100 до 10.000 пати поголема (Preuss et al. 2003). Откриено е дека нафталинот, особено, има респираторна токсичност и канцерогеност специфична за видот, регионот и полот. Врз основа на студии на животни, Меѓународната агенција за истражување на ракот (IARC) го класифицираше нафталинот како „можен човечки канцероген“ (Група 2Б)1. Изложеноста на супституирани нафталини, првенствено преку инхалација или парентерална (орална) администрација, предизвикува повреда на белодробното ткиво и ја зголемува инциденцата на белодробни тумори кај стаорци и глувци (Национална програма за токсикологија 2). Акутните ефекти вклучуваат гадење, повраќање, абдоминална болка, дијареја, главоболка, конфузија, обилно потење, треска, тахикардија итн. Од друга страна, за широкоспектрниот карбаматен инсектицид карбарил (1-нафтил N-метилкарбамат) е објавено дека е токсичен за водните безрбетници, водоземците, медоносните пчели и луѓето и е докажано дека ја инхибира ацетилхолинестеразата предизвикувајќи парализа (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). Затоа, разбирањето на механизмите на микробна деградација, генетската регулација, ензимските и клеточните реакции е клучно за развој на стратегии за биоремедијација во контаминирани средини.
Табела 2. Детални информации за физичко-хемиските својства, употребата, методите за идентификација и поврзаните болести на нафталинот и неговите деривати.
Во загадените ниши, хидрофобните и липофилните ароматични загадувачи можат да предизвикаат различни клеточни ефекти врз микробиомот (заедницата) на животната средина, како што се промени во флуидноста на мембраната, пропустливоста на мембраната, отекување на липидниот двослој, нарушување на преносот на енергија (синџир за транспорт на електрони/движечка сила на протони) и активност на протеините поврзани со мембраната (Sikkema et al., 1995). Покрај тоа, некои растворливи меѓупроизводи како што се катехоли и хинони генерираат реактивни кислородни видови (ROS) и формираат адукти со ДНК и протеини (Penning et al., 1999). Така, изобилството на такви соединенија во екосистемите врши селективен притисок врз микробните заедници да станат ефикасни деградатори на различни физиолошки нивоа, вклучувајќи апсорпција/транспорт, интрацелуларна трансформација, асимилација/искористување и компартментализација.
Пребарувањето на Проектот за рибозомална база на податоци-II (RDP-II) откри дека вкупно 926 бактериски видови биле изолирани од медиуми или култури за збогатување контаминирани со нафталин или негови деривати. Групата Proteobacteria имала најголем број претставници (n = 755), проследена од Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) и некласифицирани бактерии (8) (Слика 2). Претставниците на γ-Proteobacteria (Pseudomonadales и Xanthomonadales) доминирале кај сите грам-негативни групи со висока содржина на G+C (54%), додека Clostridiales и Bacillales (30%) биле грам-позитивни групи со ниска содржина на G+C. За Pseudomonas (најголем број, 338 видови) е објавено дека се способни да го разградат нафталинот и неговите метил деривати во различни загадени екосистеми (катран од јаглен, нафта, сурова нафта, кал, дамки од нафта, отпадни води, органски отпад и депонии), како и во недопрени екосистеми (почва, реки, седименти и подземни води) (Слика 2). Покрај тоа, студиите за збогатување и метагеномската анализа на некои од овие региони покажаа дека некултивираните видови Legionella и Clostridium може да имаат капацитет за разградување, што укажува на потребата од култивирање на овие бактерии за проучување на нови патишта и метаболичка разновидност.
Сл. 2. Таксономска разновидност и еколошка дистрибуција на бактериски претставници во средини контаминирани со нафталин и деривати на нафталин.
Меѓу различните микроорганизми кои разградуваат ароматични јаглеводороди, повеќето се способни да го разградат нафталинот како единствен извор на јаглерод и енергија. Редоследот на настаните вклучени во метаболизмот на нафталинот е опишан за Pseudomonas sp. (соеви: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 и CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 и други соеви (ND6 и AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Метаболизмот е инициран од мултикомпонентна диоксигеназа [нафтален диоксигеназа (NDO), диоксигеназа што го хидроксилира прстенот] што катализира оксидација на еден од ароматичните прстени на нафталинот користејќи молекуларен кислород како друг супстрат, претворајќи го нафталенот во цис-нафталендиол (Слика 3). Цис-дихидродиолот се претвора во 1,2-дихидроксинафтален преку дехидрогеназа. Диоксигеназа што го расцепува прстенот, 1,2-дихидроксинафтален диоксигеназа (12DHNDO), го претвора 1,2-дихидроксинафталенот во 2-хидроксихромен-2-карбоксилна киселина. Ензимската цис-транс изомеризација произведува транс-о-хидроксибензилиденпируват, кој се расцепува од хидратаза алдолаза во салицилен алдехид и пируват. Органската киселина пируват беше првото C3 соединение добиено од јаглеродниот скелет на нафталинот и насочено кон централниот јаглероден пат. Покрај тоа, NAD+-зависната салициладехид дехидрогеназа го претвора салициладехидот во салицилна киселина. Метаболизмот во оваа фаза се нарекува „горен пат“ на разградување на нафталенот. Овој пат е многу чест кај повеќето бактерии што го разградуваат нафталинот. Сепак, постојат неколку исклучоци; на пример, кај термофилниот Bacillus hamburgii 2, разградувањето на нафталенот е иницирано од нафталин 2,3-диоксигеназа за да се формира 2,3-дихидроксинафтален (Annweiler et al., 2000).
Слика 3. Патишта на разградување на нафтален, метилнафтален, нафтоева киселина и карбарил. Заокружените броеви ги претставуваат ензимите одговорни за секвенцијалната конверзија на нафталенот и неговите деривати во последователни производи. 1 — нафталин диоксигеназа (NDO); 2, цис-дихидродиол дехидрогеназа; 3, 1,2-дихидроксинафтален диоксигеназа; 4, 2-хидроксихромен-2-карбоксилна киселинска изомераза; 5, транс-О-хидроксибензилиденпируват хидратаза алдолаза; 6, салицилалдехид дехидрогеназа; 7, салицилат 1-хидроксилаза; 8, катехол 2,3-диоксигеназа (C23DO); 9, 2-хидроксимуконат семиалдехид дехидрогеназа; 10, 2-оксопент-4-еноат хидратаза; 11, 4-хидрокси-2-оксопентаноат алдолаза; 12, ацеталдехид дехидрогеназа; 13, катехол-1,2-диоксигеназа (C12DO); 14, муконат циклоизомераза; 15, муконолактон делта-изомераза; 16, β-кетоадипатенолактон хидролаза; 17, β-кетоадипат сукцинил-CoA трансфераза; 18, β-кетоадипат-CoA тиолаза; 19, сукцинил-CoA: ацетил-CoA сукцинилтрансфераза; 20, салицилат 5-хидроксилаза; 21 – гентизат 1,2-диоксигеназа (GDO); 22, малеилпируват изомераза; 23, фумарилпируват хидролаза; 24, метилнафтален хидроксилаза (NDO); 25, хидроксиметилнафтален дехидрогеназа; 26, нафталдехид дехидрогеназа; 27, 3-формилсалицилна киселина оксидаза; 28, хидроксиизофталат декарбоксилаза; 29, карбарил хидролаза (CH); 30, 1-нафтол-2-хидроксилаза.
Во зависност од организмот и неговиот генетски состав, добиената салицилна киселина понатаму се метаболизира или преку катехолниот пат со употреба на салицилат 1-хидроксилаза (S1H) или преку гентизатниот пат со употреба на салицилат 5-хидроксилаза (S5H) (Слика 3). Бидејќи салицилната киселина е главниот меѓупроизвод во метаболизмот на нафтален (горен пат), чекорите од салицилна киселина до TCA меѓупроизводот често се нарекуваат долен пат, а гените се организирани во еден оперон. Вообичаено е да се види дека гените во оперонот на горниот пат (nah) и оперонот на долниот пат (sal) се регулирани од заеднички регулаторни фактори; на пример, NahR и салицилната киселина дејствуваат како индуктори, дозволувајќи им на двата оперони целосно да го метаболизираат нафталенот (Phale et al., 2019, 2020).
Дополнително, катехолот циклично се разложува до 2-хидроксимуконат семиалдехид преку мета-патеката од страна на катехол 2,3-диоксигеназа (C23DO) (Yen et al., 1988) и понатаму се хидролизира од страна на 2-хидроксимуконат семиалдехид хидролаза за да се формира 2-хидроксипент-2,4-диеноична киселина. 2-хидроксипент-2,4-диеноатот потоа се претвора во пируват и ацеталдехид од страна на хидратаза (2-оксопент-4-еноат хидратаза) и алдолаза (4-хидрокси-2-оксопентаноат алдолаза) и потоа влегува во централниот јаглероден пат (Слика 3). Алтернативно, катехолот циклично се разложува до цис,цис-муконат преку орто-патеката од страна на катехол 1,2-оксигеназа (C12DO). Муконат циклоизомеразата, муконолактон изомеразата и β-кетоадипат-нолактон хидролазата го претвораат цис, цис-муконатот во 3-оксоадипат, кој влегува во централниот јаглероден пат преку сукцинил-CoA и ацетил-CoA (Nozaki et al., 1968) (Слика 3).
Во гентизат (2,5-дихидроксибензоат) патеката, ароматичниот прстен се раскинува од гентизат 1,2-диоксигеназа (GDO) за да се формира малеилпируват. Овој производ може директно да се хидролизира до пируват и малат, или може да се изомеризира за да се формира фумарилпируват, кој потоа може да се хидролизира до пируват и фумарат (Larkin and Day, 1986). Изборот на алтернативен пат е забележан и кај грам-негативните и кај грам-позитивните бактерии на биохемиско и генетско ниво (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Грам-негативните бактерии (Pseudomonas) претпочитаат да користат салицилна киселина, која е индуктор на метаболизмот на нафталин, декарбоксилирајќи ја до катехол користејќи салицилат 1-хидроксилаза (Gibson and Subramanian, 1984). Од друга страна, кај грам-позитивните бактерии (Rhodococcus), салицилат 5-хидроксилазата ја претвора салицилната киселина во гентисинска киселина, додека салицилната киселина нема индуктивен ефект врз транскрипцијата на гените за нафталин (Grund et al., 1992) (Слика 3).
Објавено е дека видови како што се Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas и Mycobacterium видовите можат да го разградат монометилнафталенот или диметилнафталенот (Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Меѓу нив, патот на разградување на 1-метилнафтален и 2-метилнафтален на Pseudomonas sp. CSV86 е јасно проучен на биохемиско и ензимско ниво (Mahajan et al., 1994). 1-метилнафталенот се метаболизира преку два пата. Прво, ароматичниот прстен се хидроксилира (несупституираниот прстен на метилнафтален) за да се формира цис-1,2-дихидрокси-1,2-дихидро-8-метилнафтален, кој понатаму се оксидира до метил салицилат и метилкатехол, а потоа влегува во централниот јаглероден пат по расцепувањето на прстенот (Слика 3). Овој пат се нарекува „патека на извор на јаглерод“. Во вториот „патека на детоксикација“, метил групата може да се хидроксилира со NDO за да се формира 1-хидроксиметилнафтален, кој понатаму се оксидира до 1-нафтоева киселина и се излачува во културната средина како производ без излез. Студиите покажаа дека сојот CSV86 не е во можност да расте на 1- и 2-нафтоева киселина како единствен извор на јаглерод и енергија, што го потврдува неговиот пат на детоксикација (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Во 2-метилнафтален, метил групата се подложува на хидроксилација со хидроксилаза за да се формира 2-хидроксиметилнафтален. Покрај тоа, несупституираниот прстен на нафталенскиот прстен се подложува на хидроксилација на прстенот за да формира дихидродиол, кој се оксидира до 4-хидроксиметилкатехол во серија ензимски катализирани реакции и влегува во централниот јаглероден пат преку мета-прстенестиот пат на расцепување. Слично, беше објавено дека S. paucimobilis 2322 користи NDO за хидроксилирање на 2-метилнафтален, кој понатаму се оксидира за да формира метил салицилат и метилкатехол (Dutta et al., 1998).
Нафтоичните киселини (супституирани/несупституирани) се нуспроизводи на детоксикација/биотрансформација формирани за време на деградацијата на метилнафтален, фенантрен и антрацен и ослободени во потрошениот медиум за култура. Објавено е дека изолатот од почвата Stenotrophomonas maltophilia CSV89 е способен да ја метаболизира 1-нафтоичната киселина како извор на јаглерод (Phale et al., 1995). Метаболизмот започнува со дихидроксилација на ароматичниот прстен за да се формира 1,2-дихидрокси-8-карбоксинафтален. Добиениот диол се оксидира до катехол преку 2-хидрокси-3-карбоксибензилиденпируват, 3-формилсалицилна киселина, 2-хидроксиизофталична киселина и салицилна киселина и влегува во централниот јаглероден пат преку патот на расцепување на мета-прстенот (Слика 3).
Карбарилот е пестицид од типот на нафтил карбамат. Од Зелената револуција во Индија во 1970-тите, употребата на хемиски ѓубрива и пестициди доведе до зголемување на емисиите на полициклични ароматични јаглеводороди (PAH) од земјоделски неточкести извори (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Се проценува дека 55% (85.722.000 хектари) од вкупното обработливо земјиште во Индија се третира со хемиски пестициди. Во текот на последните пет години (2015–2020), индискиот земјоделски сектор користел просечно од 55.000 до 60.000 тони пестициди годишно (Оддел за задруги и благосостојба на земјоделците, Министерство за земјоделство, Влада на Индија, август 2020 година). Во северните и централните Гангски рамнини (државите со најголема популација и густина на население), употребата на пестициди на земјоделските култури е широко распространета, при што доминираат инсектицидите. Карбарил (1-нафтил-N-метилкарбамат) е широк спектар, умерено до високо токсичен инсектицид од типот карбамат кој се користи во индиското земјоделство со просечна количина од 100-110 тони. Најчесто се продава под трговското име Севин и се користи за контрола на инсекти (лисни вошки, огнени мравки, болви, грини, пајаци и многу други штетници на отворено) кои влијаат на различни култури (пченка, соја, памук, овошје и зеленчук). Некои микроорганизми како што се Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus и Arthrobacter може да се користат и за контрола на други штетници. Објавено е дека RC100 може да го разгради карбарилот (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Патот на разградување на карбарилот е опширно проучен на биохемиско, ензимско и генетско ниво во почвени изолати на Pseudomonas sp. соеви C4, C5 и C6 (Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (сл. 3). Метаболичкиот пат започнува со хидролиза на естерската врска од страна на карбарил хидролаза (CH4) за да се формира 1-нафтол, метиламин и јаглерод диоксид. 1-нафтолот потоа се претвора во 1,2-дихидроксинафтален од страна на 1-нафтол хидроксилаза (1-NH), кој понатаму се метаболизира преку централниот јаглероден пат преку салицилат и гентизат. Пријавено е дека некои бактерии што го разградуваат карбарилот го метаболизираат во салицилна киселина преку раскинување на катехолниот орто прстен (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). Имено, бактериите што го разградуваат нафталинот првенствено ја метаболизираат салицилната киселина преку катехол, додека бактериите што го разградуваат карбарилот претпочитаат да ја метаболизираат салицилната киселина преку гентизатниот пат.
Дериватите на нафталинсулфонска киселина/дисулфонска киселина и нафтиламинсулфонска киселина може да се користат како меѓупроизводи во производството на азо бои, средства за влажнење, дисперзанти итн. Иако овие соединенија имаат ниска токсичност за луѓето, проценките на цитотоксичноста покажаа дека се смртоносни за риби, дафнија и алги (Greim et al., 1994). Пријавено е дека претставниците на родот Pseudomonas (соеви A3, C22) го иницираат метаболизмот со двојна хидроксилација на ароматичниот прстен што ја содржи групата на сулфонска киселина за да формираат дихидродиол, кој понатаму се претвора во 1,2-дихидроксинафтален со спонтано расцепување на сулфитната група (Brilon et al., 1981). Резултирачкиот 1,2-дихидроксинафтален се катаболизира преку класичниот пат на нафтален, т.е. патот на катехол или гентизат (Слика 4). Покажано е дека аминонафталенсулфонската киселина и хидроксинафталенсулфонската киселина можат целосно да се разградат од мешани бактериски конзорциуми со комплементарни катаболни патишта (Nortemann et al., 1986). Покажано е дека еден член на конзорциумот ја десулфуризира аминонафталенсулфонската киселина или хидроксинафталенсулфонската киселина преку 1,2-диоксигенација, додека аминосалицилатот или хидроксисалицилатот се ослободува во култивираната средина како метаболит без крај и последователно се апсорбира од другите членови на конзорциумот. Нафталендисулфонската киселина е релативно поларна, но слабо биоразградлива и затоа може да се метаболизира преку различни патишта. Првата десулфуризација се јавува за време на региоселективна дихидроксилација на ароматичниот прстен и групата на сулфонска киселина; Втората десулфуризација се јавува за време на хидроксилација на 5-сулфосалицилна киселина од страна на салицилна кисела 5-хидроксилаза за да се формира гентисинска киселина, која влегува во централниот јаглероден пат (Brilon et al., 1981) (Слика 4). Ензимите одговорни за разградување на нафталин се исто така одговорни за метаболизмот на нафталин сулфонат (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Слика 4. Метаболни патишта за разградување на нафталин сулфонат. Броевите во круговите ги претставуваат ензимите одговорни за метаболизмот на нафтил сулфонат, слични/идентични со ензимите опишани на Сл. 3.
PAH со мала молекуларна тежина (LMW-PAH) се редуцибилни, хидрофобни и слабо растворливи, и затоа не се подложни на природно распаѓање/деградација. Сепак, аеробните микроорганизми се способни да ги оксидираат со апсорбирање на молекуларен кислород (O2). Овие ензими главно припаѓаат на класата на оксидоредуктази и можат да извршат различни реакции како што се хидроксилација на ароматичен прстен (моно- или дихидроксилација), дехидрогенација и расцепување на ароматичен прстен. Производите добиени од овие реакции се во повисока оксидациска состојба и полесно се метаболизираат преку централниот јаглероден пат (Phale et al., 2020). Ензимите во патот на деградација се пријавени како индуцибилни. Активноста на овие ензими е многу ниска или занемарлива кога клетките се одгледуваат на едноставни извори на јаглерод како што се гликоза или органски киселини. Табела 3 ги сумира различните ензими (оксигенази, хидролази, дехидрогенази, оксидази, итн.) вклучени во метаболизмот на нафталин и неговите деривати.
Табела 3. Биохемиски карактеристики на ензимите одговорни за разградување на нафталинот и неговите деривати.
Студиите за радиоизотоп (18O2) покажаа дека инкорпорирањето на молекуларен O2 во ароматични прстени од страна на оксигеназите е најважниот чекор во активирањето на понатамошната биоразградливост на соединението (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Инкорпорирањето на еден атом на кислород (O) од молекуларниот кислород (O2) во подлогата е иницирано од ендогени или егзогени монооксигенази (исто така наречени хидроксилази). Друг атом на кислород се редуцира во вода. Егзогените монооксигенази го редуцираат флавинот со NADH или NADPH, додека кај ендомонооксигеназите флавинот се редуцира од подлогата. Позицијата на хидроксилација резултира со разновидност во формирањето на производот. На пример, салицилат 1-хидроксилазата ја хидроксилира салицилната киселина на позицијата C1, формирајќи катехол. Од друга страна, мултикомпонентната салицилат 5-хидроксилаза (која содржи редуктаза, фередоксин и оксигеназни подгрупи) ја хидроксилира салицилната киселина на позицијата C5, формирајќи гентисинска киселина (Yamamoto et al., 1965).
Диоксигеназите инкорпорираат два атоми на O2 во подлогата. Во зависност од формираните производи, тие се поделени на хидроксилирачки диоксигенази на прстенот и диоксигенази на прстенот што го расцепуваат. Хидроксилирачките диоксигенази на прстенот ги претвораат ароматичните супстрати во цис-дихидродиоли (на пр., нафталин) и се широко распространети меѓу бактериите. До денес, е покажано дека организмите што содржат хидроксилирачки диоксигенази на прстенот се способни да растат на различни ароматични извори на јаглерод, а овие ензими се класифицирани како NDO (нафталин), толуен диоксигеназа (TDO, толуен) и бифенил диоксигеназа (BPDO, бифенил). И NDO и BPDO можат да катализираат двојна оксидација и хидроксилација на страничниот ланец на разни полициклични ароматични јаглеводороди (толуен, нитротолуен, ксилен, етилбензен, нафтален, бифенил, флуорен, индол, метилнафтален, нафталенсулфонат, фенантрен, антрацен, ацетофенон, итн.) (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO е повеќекомпонентен систем кој се состои од оксидоредуктаза, фередоксин и компонента на оксигеназа што содржи активно место (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Каталитичката единица на NDO се состои од голема α подгрупа и мала β подгрупа распоредени во α3β3 конфигурација. NDO припаѓа на големо семејство на оксигенази, а неговата α-подединица содржи Риске место [2Fe-2S] и мононуклеарно нехемско железо, кое ја одредува специфичноста на супстратот на NDO (Parales et al., 1998). Типично, во еден каталитички циклус, два електрони од редукцијата на пиридинскиот нуклеотид се пренесуваат на јон Fe(II) во активното место преку редуктаза, фередоксин и Риске место. Редуцирачките еквиваленти го активираат молекуларниот кислород, што е предуслов за дихидроксилација на супстратот (Ferraro et al., 2005). До денес, само неколку NDO се прочистени и детално карактеризирани од различни соеви, а генетската контрола на патиштата вклучени во деградацијата на нафталинот е детално проучена (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Диоксигеназите што го расцепуваат прстенот (ендо- или орто-ензими што го расцепуваат прстенот и егзодиол- или мета-ензими што го расцепуваат прстенот) дејствуваат врз хидроксилираните ароматични соединенија. На пример, орто-диоксигеназата што го расцепува прстенот е катехол-1,2-диоксигеназа, додека мета-диоксигеназата што го расцепува прстенот е катехол-2,3-диоксигеназа (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Покрај различните оксигенази, постојат и различни дехидрогенази одговорни за дехидрогенација на ароматични дихидродиоли, алкохоли и алдехиди и користење на NAD+/NADP+ како акцептори на електрони, кои се некои од важните ензими вклучени во метаболизмот (Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Ензими како што се хидролазите (естерази, амидази) се втора важна класа на ензими кои користат вода за раскинување на ковалентни врски и покажуваат широка специфичност на супстратот. Карбарил хидролазата и другите хидролази се сметаат за компоненти на периплазмата (трансмембранска) кај членовите на грам-негативните бактерии (Kamini et al., 2018). Карбарилот има и амидска и естерска врска; затоа, може да се хидролизира со естераза или амидаза за да се формира 1-нафтол. Карбарилот во сојот Rhizobium rhizobium AC10023 и сојот Arthrobacter RC100 е објавено дека функционира како естераза и амидаза, соодветно. Карбарилот во сојот Arthrobacter RC100 исто така функционира како амидаза. Докажано е дека RC100 хидролизира четири инсектициди од класата на N-метилкарбамат, како што се карбарил, метомил, мефенаминска киселина и XMC (Hayaatsu et al., 2001). Беше објавено дека CH во Pseudomonas sp. C5pp може да дејствува на карбарил (100% активност) и 1-нафтил ацетат (36% активност), но не и на 1-нафтилацетамид, што укажува дека станува збор за естераза (Trivedi et al., 2016).
Биохемиските студии, моделите на регулирање на ензимите и генетската анализа покажаа дека гените за разградување на нафталенот се состојат од две индуцибилни регулаторни единици или „операни“: nah („нагорниот пат“, кој го претвора нафталенот во салицилна киселина) и sal („надолниот пат“, кој ја претвора салицилната киселина во централниот јаглероден пат преку катехол). Салицилната киселина и нејзините аналози можат да дејствуваат како индуктори (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). Во присуство на гликоза или органски киселини, оперонот е потиснат. Слика 5 ја прикажува целосната генетска организација на разградувањето на нафталенот (во форма на оперон). Опишани се неколку именувани варијанти/форми на генот nah (ndo/pah/dox) и е утврдено дека имаат висока секвенцијална хомологија (90%) кај сите видови Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Гените на нагорниот пат на нафталенот генерално се распоредени по консензусен редослед како што е прикажано на Слика 5А. Друг ген, nahQ, исто така беше објавен како вклучен во метаболизмот на нафталин и обично се наоѓаше помеѓу nahC и nahE, но неговата вистинска функција останува да се разјасни. Слично на тоа, генот nahY, одговорен за хемотакса чувствителна на нафталин, беше пронајден на дисталниот крај на nah оперонот кај некои членови. Кај Ralstonia sp., генот U2 што кодира глутатион S-трансфераза (gsh) беше пронајден помеѓу nahAa и nahAb, но не влијаеше на карактеристиките на искористување на нафталин (Zylstra et al., 1997).
Слика 5. Генетска организација и разновидност забележани за време на деградацијата на нафталенот кај бактериските видови; (A) Горен нафталенски пат, метаболизам на нафталенот во салицилна киселина; (B) Долен нафталенски пат, салицилна киселина преку катехол до централниот јаглероден пат; (C) салицилна киселина преку гентизат до централниот јаглероден пат.
„Долниот пат“ (sal оперон) обично се состои од nahGTHINLMOKJ и го претвора салицилатот во пируват и ацеталдехид преку патот на расцепување на катехолот. Генот nahG (кој кодира салицилат хидроксилаза) е конзервиран на проксималниот крај на оперонот (Сл. 5B). Во споредба со другите соеви што го разградуваат нафталинот, кај P. putida CSV86 опероните nah и sal се тандемски и многу тесно поврзани (околу 7,5 kb). Кај некои грам-негативни бактерии, како што се Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 и P. putida AK5, нафталинот се метаболизира како централен јаглероден метаболит преку патот gentisate (во форма на sgp/nag оперонот). Генската касета обично е претставена во форма nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, каде што nagR (кој кодира регулатор од типот LysR) се наоѓа на горниот крај (Слика 5C).
Карбарилот влегува во централниот јаглероден циклус преку метаболизмот на 1-нафтол, 1,2-дихидроксинафтален, салицилна киселина и гентизинска киселина (Слика 3). Врз основа на генетски и метаболички студии, предложено е да се подели овој пат на „горе“ (конверзија на карбарил во салицилна киселина), „среден“ (конверзија на салицилна киселина во гентизинска киселина) и „долг“ (конверзија на гентизинска киселина во меѓупроизводи на централниот јаглероден пат) (Singh et al., 2013). Геномската анализа на C5pp (суперконтиг А, 76,3 kb) покажа дека генот mcbACBDEF е вклучен во конверзијата на карбарил во салицилна киселина, проследен со mcbIJKL во конверзијата на салицилна киселина во гентизинска киселина и mcbOQP во конверзијата на гентизинска киселина во централни јаглеродни меѓупроизводи (фумарат и пируват, Trivedi et al., 2016) (Слика 6).
Објавено е дека ензимите вклучени во разградувањето на ароматичните јаглеводороди (вклучувајќи нафтален и салицилна киселина) можат да бидат индуцирани од соодветните соединенија и инхибирани од едноставни извори на јаглерод како што се гликоза или органски киселини (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Меѓу различните метаболички патишта на нафталенот и неговите деривати, регулаторните карактеристики на нафталенот и карбарилот се проучени до одреден степен. За нафталенот, гените и во горните и во долните патишта се регулирани од NahR, транс-дејствувачки позитивен регулатор од типот LysR. Тој е потребен за индукција на генот nah од салицилна киселина и неговата последователна експресија на високо ниво (Yen and Gunsalus, 1982). Понатаму, студиите покажаа дека интегративниот фактор на домаќинот (IHF) и XylR (sigma 54-зависен транскрипциски регулатор) се исто така критични за транскрипциската активација на гените во метаболизмот на нафталенот (Ramos et al., 1997). Студиите покажаа дека ензимите на патот за отворање на катехолниот мета-прстен, имено катехол 2,3-диоксигеназа, се индуцираат во присуство на нафталин и/или салицилна киселина (Basu et al., 2006). Студиите покажаа дека ензимите на патот за отворање на катехолниот орто-прстен, имено катехол 1,2-диоксигеназа, се индуцираат во присуство на бензоева киселина и цис, цис-муконат (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Во сојот C5pp, пет гени, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR и mcbS, кодираат регулатори кои припаѓаат на семејството LysR/TetR на транскрипциски регулатори одговорни за контрола на деградацијата на карбарил. Хомологниот ген mcbG е најтесно поврзан со регулаторот PhnS од типот LysR (58% идентитет на аминокиселини) вклучен во метаболизмот на фенантренот кај Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Генот mcbH е вклучен во средниот пат (конверзија на салицилна киселина во гентисинска киселина) и припаѓа на транскрипцискиот регулатор NagR/DntR/NahR од типот LysR кај Pseudomonas и Burkholderia. Пријавено е дека членовите на ова семејство ја препознаваат салицилната киселина како специфична ефекторна молекула за индукција на гени за деградација. Од друга страна, три гени, mcbN, mcbR и mcbS, кои припаѓаат на транскрипционите регулатори од типот LysR и TetR, беа идентификувани во низводниот пат (гентисат-централен јаглероден пат - метаболити).
Кај прокариотите, хоризонталните процеси на трансфер на гени (стекнување, размена или пренос) преку плазмиди, транспозони, профаги, геномски острови и интегративни конјугативни елементи (ICE) се главни причини за пластичност кај бактериските геноми, што доведува до добивање или губење на специфични функции/особини. Тоа им овозможува на бактериите брзо да се адаптираат на различни услови на животната средина, обезбедувајќи потенцијални адаптивни метаболички предности за домаќинот, како што е деградацијата на ароматични соединенија. Метаболните промени често се постигнуваат преку фино подесување на опероните за деградација, нивните регулаторни механизми и ензимските специфичности, што го олеснува деградацијата на поширок опсег на ароматични соединенија (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Генските касети за деградација на нафталин се наоѓаат на различни мобилни елементи како што се плазмиди (конјугативни и неконјугативни), транспозони, геноми, ICE и комбинации од различни бактериски видови (Слика 5). Кај Pseudomonas G7, nah и sal опероните на плазмидот NAH7 се транскрибираат во иста ориентација и се дел од дефектен транспозон на кој му е потребна транспозаза Tn4653 за мобилизација (Sota et al., 2006). Кај Pseudomonas сојот NCIB9816-4, генот е пронајден на конјугативниот плазмид pDTG1 како два оперони (оддалечени приближно 15 kb) кои се транскрибирани во спротивни насоки (Dennis and Zylstra, 2004). Кај Pseudomonas putida сојот AK5, неконјугативниот плазмид pAK5 го кодира ензимот одговорен за деградација на нафталин преку гентисатниот пат (Izmalkova et al., 2013). Кај Pseudomonas сојот PMD-1, nah оперонот се наоѓа на хромозомот, додека sal оперонот се наоѓа на конјугативниот плазмид pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Сепак, кај Pseudomonas stutzeri AN10, сите гени за деградација на нафталин (nah и sal оперони) се наоѓаат на хромозомот и веројатно се регрутирани преку транспозиција, рекомбинација и настани на преуредување (Bosch et al., 2000). Кај Pseudomonas sp. CSV86, nah и sal опероните се наоѓаат во геномот во форма на ICE (ICECSV86). Структурата е заштитена со tRNAGly проследено со директни повторувања што укажуваат на места на рекомбинација/прицврстување (attR и attL) и интеграза слична на фаг лоцирана на двата краја на tRNAGly, со што е структурно слична на елементот ICEclc (ICEclcB13 кај Pseudomonas knackmusii за деградација на хлорокатехол). Објавено е дека гените на ICE можат да се пренесат преку конјугација со екстремно ниска фреквенција на пренос (10-8), со што се пренесуваат својствата на деградација на примателот (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Повеќето од гените одговорни за разградување на карбарил се наоѓаат на плазмиди. Arthrobacter sp. RC100 содржи три плазмиди (pRC1, pRC2 и pRC300) од кои два конјугативни плазмиди, pRC1 и pRC2, ги кодираат ензимите кои го претвораат карбарилот во гентизат. Од друга страна, ензимите вклучени во конверзијата на гентизатот во централните јаглеродни метаболити се наоѓаат на хромозомот (Hayaatsu et al., 1999). Бактерии од родот Rhizobium. Сојот AC100, кој се користи за конверзија на карбарил во 1-нафтол, го содржи плазмидот pAC200, кој го носи генот cehA што кодира CH како дел од транспозонот Tnceh опкружен со секвенци слични на елементи за вметнување (istA и istB) (Hashimoto et al., 2002). Кај сојот Sphingomonas CF06, се верува дека генот за деградација на карбарил е присутен во пет плазмиди: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 и pCF05. ДНК хомологијата на овие плазмиди е висока, што укажува на постоење на настан на дупликација на генот (Feng et al., 1997). Кај симбионт што го деградира карбарилот составен од два вида Pseudomonas, сојот 50581 содржи конјугативен плазмид pCD1 (50 kb) што го кодира генот mcd карбарил хидролаза, додека конјугативниот плазмид во сојот 50552 кодира ензим што го деградира 1-нафтолот (Chapalamadugu и Chaudhry, 1991). Кај сојот Achromobacter WM111, генот за mcd фурадан хидролаза се наоѓа на плазмид од 100 kb (pPDL11). Овој ген е присутен на различни плазмиди (100, 105, 115 или 124 kb) кај различни бактерии од различни географски региони (Parekh et al., 1995). Кај Pseudomonas sp. C5pp, сите гени одговорни за разградување на карбарил се наоѓаат во геном што опфаќа 76,3 kb секвенца (Trivedi et al., 2016). Анализата на геномот (6,15 Mb) откри присуство на 42 MGE и 36 GEI, од кои 17 MGE беа лоцирани во суперконтиг А (76,3 kb) со просечна асиметрична содржина на G+C (54–60 mol%), што укажува на можни хоризонтални настани на трансфер на гени (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 покажува сличен распоред на гени што го разградуваат карбарилот, но овие гени се наоѓаат на плазмид (Zhu et al., 2019).
Покрај метаболичката ефикасност на биохемиско и геномско ниво, микроорганизмите покажуваат и други својства или реакции како што се хемотакса, својства на модификација на клеточната површина, компартментизација, преференцијално искористување, производство на биосурфактанти итн., што им помага поефикасно да ги метаболизираат ароматичните загадувачи во контаминирани средини (Слика 7).
Слика 7. Различни стратегии на клеточен одговор на идеални бактерии што разградуваат ароматични јаглеводороди за ефикасна биоразградба на туѓи загадувачки соединенија.
Хемотаксичните одговори се сметаат за фактори што го зголемуваат разградувањето на органските загадувачи во хетерогено загадените екосистеми. (2002) покажаа дека хемотаксата на Pseudomonas sp. G7 до нафталин ја зголемила стапката на разградување на нафталенот во водните системи. Сојот од див тип G7 го разградил нафталенот многу побрзо од мутантниот сој со недостаток на хемотакса. Протеинот NahY (538 аминокиселини со мембранска топологија) се покажа дека е ко-транскрибиран со гените за патеката на метаразградување на плазмидот NAH7, и како трансдуктори за хемотакса, овој протеин се чини дека функционира како хеморецептор за разградување на нафтален (Grimm and Harwood 1997). Друга студија од Hansel et al. (2009) покажа дека протеинот е хемотактичен, но неговата стапка на разградување е висока. (2011) покажаа хемотактичен одговор на Pseudomonas (P. putida) на гасовит нафталин, при што дифузијата во гасна фаза резултираше со постојан проток на нафталин до клетките, што го контролираше хемотактичкиот одговор на клетките. Истражувачите го искористија ова хемотактичко однесување за да создадат микроби кои би ја зголемиле стапката на деградација. Студиите покажаа дека хемосензорните патишта регулираат и други клеточни функции како што се клеточната делба, регулацијата на клеточниот циклус и формирањето на биофилм, со што помагаат да се контролира стапката на деградација. Сепак, искористувањето на ова својство (хемотаксис) за ефикасна деградација е попречено од неколку тесни грла. Главните пречки се: (а) различни паралогни рецептори ги препознаваат истите соединенија/лиганди; (б) постоење на алтернативни рецептори, т.е. енергетски тропизам; (в) значајни разлики во секвенцата во сензорните домени на истото семејство рецептори; и (г) недостаток на информации за главните бактериски сензорни протеини (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Понекогаш, биоразградувањето на ароматичните јаглеводороди произведува повеќе метаболити/интермедијари, кои можат да бидат хемотактични за една група бактерии, но одбивни за други, што дополнително го комплицира процесот. За да ги идентификуваме интеракциите на лигандите (ароматични јаглеводороди) со хемиските рецептори, конструиравме хибридни сензорски протеини (PcaY, McfR и NahY) со спојување на сензорските и сигналните домени на Pseudomonas putida и Escherichia coli, кои ги таргетираат рецепторите за ароматични киселини, TCA интермедијари и нафталин, соодветно (Luu et al., 2019).
Под влијание на нафталин и други полициклични ароматични јаглеводороди (PAH), структурата на бактериската мембрана и интегритетот на микроорганизмите претрпуваат значителни промени. Студиите покажаа дека нафталинот се меша во интеракцијата на ацилниот ланец преку хидрофобни интеракции, со што се зголемува отокот и флуидноста на мембраната (Sikkema et al., 1995). За да се спротивстави на овој штетен ефект, бактериите ја регулираат флуидноста на мембраната со промена на односот и составот на масните киселини помеѓу изо/антиизо масни киселини со разгранет ланец и изомеризирање на цис-незаситените масни киселини во соодветните транс-изомери (Heipieper and de Bont, 1994). Кај Pseudomonas stutzeri одгледуван на третман со нафталин, односот на заситени и незаситени масни киселини се зголемил од 1,1 на 2,1, додека кај Pseudomonas JS150 овој однос се зголемил од 7,5 на 12,0 (Mrozik et al., 2004). Кога се одгледувале на нафталин, клетките на Achromobacter KAs 3–5 покажале клеточна агрегација околу кристалите на нафтален и намалување на полнежот на клеточната површина (од -22,5 до -2,5 mV) придружено со цитоплазматска кондензација и вакуолизација, што укажува на промени во клеточната структура и својствата на клеточната површина (Mohapatra et al., 2019). Иако клеточните/површинските промени се директно поврзани со подобро апсорбирање на ароматични загадувачи, релевантните стратегии за биоинженерство не се целосно оптимизирани. Манипулацијата со обликот на клетката ретко се користела за оптимизирање на биолошките процеси (Volke and Nikel, 2018). Делецијата на гените што влијаат на клеточната делба предизвикува промени во морфологијата на клетката. Делецијата на гените што влијаат на клеточната делба предизвикува промени во морфологијата на клетката. Кај Bacillus subtilis, покажано е дека протеинот на клеточниот септум SepF е вклучен во формирањето на септумот и е потребен за последователните чекори на клеточната делба, но не е суштински ген. Делецијата на гените што кодираат пептидни гликански хидролази во Bacillus subtilis резултираше со издолжување на клетките, зголемена специфична стапка на раст и подобрен капацитет за производство на ензими (Cui et al., 2018).
Предложена е компартментализација на патот на деградација на карбарилот за да се постигне ефикасна деградација на соевите Pseudomonas C5pp и C7 (Kamini et al., 2018). Предложено е карбарилот да се транспортира во периплазматскиот простор преку септумот на надворешната мембрана и/или преку дифузибилни порини. CH е периплазматски ензим кој ја катализира хидролизата на карбарилот до 1-нафтол, кој е постабилен, похидрофобен и потоксичен. CH е локализиран во периплазмата и има низок афинитет за карбарил, со што се контролира формирањето на 1-нафтол, со што се спречува неговата акумулација во клетките и се намалува неговата токсичност за клетките (Kamini et al., 2018). Резултирачкиот 1-нафтол се транспортира во цитоплазмата преку внатрешната мембрана со партиционирање и/или дифузија, а потоа се хидроксилира до 1,2-дихидроксинафтален од страна на ензимот со висок афинитет 1NH за понатамошен метаболизам во централниот јаглероден пат.
Иако микроорганизмите имаат генетски и метаболички способности за разградување на ксенобиотски извори на јаглерод, хиерархиската структура на нивното користење (т.е. преференцијална употреба на едноставни наспроти сложени извори на јаглерод) е голема пречка за биоразградување. Присуството и користењето на едноставни извори на јаглерод ги намалува гените што кодираат ензими кои ги разградуваат сложените/непреферираните извори на јаглерод, како што се PAHs. Добро проучен пример е тоа што кога гликозата и лактозата се внесуваат заедно во Escherichia coli, гликозата се користи поефикасно од лактозата (Jacob and Monod, 1965). Пријавено е дека Pseudomonas разградува различни PAHs и ксенобиотски соединенија како извори на јаглерод. Хиерархијата на користење на извори на јаглерод кај Pseudomonas е органски киселини > гликоза > ароматични соединенија (Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Сепак, постои исклучок. Интересно е што Pseudomonas sp. CSV86 покажува единствена хиерархиска структура која преференцијално користи ароматични јаглеводороди (бензоева киселина, нафталин, итн.) наместо гликоза и ко-метаболизира ароматични јаглеводороди со органски киселини (Basu et al., 2006). Кај оваа бактерија, гените за разградување и транспорт на ароматични јаглеводороди не се намалени дури и во присуство на втор извор на јаглерод како што се гликоза или органски киселини. Кога се одгледува во средина со гликоза и ароматични јаглеводороди, беше забележано дека гените за транспорт и метаболизам на гликоза беа намалени, ароматичните јаглеводороди беа искористени во првата логаритамска фаза, а гликозата беше искористена во втората логаритамска фаза (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Од друга страна, присуството на органски киселини не влијаеше на експресијата на метаболизмот на ароматични јаглеводороди, па затоа се очекува оваа бактерија да биде кандидатски сој за студии за биоразградливост (Phale et al., 2020).
Добро е познато дека биотрансформацијата на јаглеводородите може да предизвика оксидативен стрес и зголемена регулација на антиоксидантните ензими кај микроорганизмите. Неефикасната биоразградба на нафталинот, како во клетките во стационарна фаза, така и во присуство на токсични соединенија, доведува до формирање на реактивни кислородни видови (ROS) (Kang et al. 2006). Бидејќи ензимите што го разградуваат нафталинот содржат кластери од железо-сулфур, под оксидативен стрес, железото во протеините на хемот и железо-сулфур ќе се оксидира, што ќе доведе до инактивација на протеините. Фередоксин-NADP+ редуктазата (Fpr), заедно со супероксид дисмутазата (SOD), посредува во реверзибилната редокс реакција помеѓу NADP+/NADPH и два молекули на фередоксин или флаводоксин, со што се отстрануваат ROS и се обновува центарот на железо-сулфур под оксидативен стрес (Li et al. 2006). Објавено е дека и Fpr и SodA (SOD) кај Pseudomonas можат да бидат предизвикани од оксидативен стрес, а зголемени активности на SOD и каталаза се забележани кај четири соеви на Pseudomonas (O1, W1, As1 и G1) за време на растот под услови на додаден нафталин (Kang et al., 2006). Студиите покажаа дека додавањето на антиоксиданси како што се аскорбинска киселина или феро железо (Fe2+) може да ја зголеми стапката на раст на нафталенот. Кога Rhodococcus erythropolis растеше во нафталенска средина, транскрипцијата на гените на цитохром P450 поврзани со оксидативен стрес, вклучувајќи sodA (Fe/Mn супероксид дисмутаза), sodC (Cu/Zn супероксид дисмутаза) и recA, беше зголемена (Sazykin et al., 2019). Компаративната квантитативна протеомска анализа на клетки на Pseudomonas култивирани во нафталин покажа дека зголемената регулација на различни протеини поврзани со одговорот на оксидативен стрес е стратегија за справување со стрес (Herbst et al., 2013).
Пријавено е дека микроорганизмите произведуваат биосурфактанти под дејство на хидрофобни извори на јаглерод. Овие сурфактанти се амфифилни површински активни соединенија кои можат да формираат агрегати на површините масло-вода или воздух-вода. Ова ја промовира псевдо-солубилизација и ја олеснува адсорпцијата на ароматични јаглеводороди, што резултира со ефикасна биоразградливост (Rahman et al., 2002). Поради овие својства, биосурфактантите се широко користени во различни индустрии. Додавањето на хемиски сурфактанти или биосурфактанти во бактериски култури може да ја зголеми ефикасноста и стапката на разградување на јаглеводородите. Меѓу биосурфактантите, рамнолипидите произведени од Pseudomonas aeruginosa се опширно проучени и карактеризирани (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Дополнително, други видови биолошки сурфактанти вклучуваат липопептиди (муцини од Pseudomonas fluorescens), емулгатор 378 (од Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg и Ron, 1999), трехалозни дисахаридни липиди од Rhodococcus (Ramdahl, 1985), лихенин од Bacillus (Saraswathy и Hallberg, 2002) и сурфактант од Bacillus subtilis (Siegmund и Wagner, 1991) и Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Докажано е дека овие моќни сурфактанти го намалуваат површинскиот напон од 72 dynes/cm на помалку од 30 dynes/cm, овозможувајќи подобра апсорпција на јаглеводороди. Објавено е дека Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia и други бактериски видови можат да произведат различни биосурфактанти базирани на рамнолипиди и гликолипиди кога се одгледуваат во нафталенска и метилнафтална средина (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 може да произведе екстрацелуларен биосурфактант Biosur-Pm кога се одгледува на ароматични соединенија како што е нафтоева киселина (Phale et al., 1995). Кинетиката на формирање на Biosur-Pm покажа дека неговата синтеза е процес зависен од растот и pH вредноста. Утврдено е дека количината на Biosur-Pm произведена од клетките при неутрална pH вредност била поголема од онаа при pH 8,5. Клетките одгледувани на pH 8,5 биле похидрофобни и имале поголем афинитет за ароматични и алифатични соединенија отколку клетките одгледувани на pH 7,0. Кај Rhodococcus spp. N6, повисокиот однос на јаглерод и азот (C:N) и ограничувањето на железото се оптимални услови за производство на екстрацелуларни биосурфактанти (Mutalik et al., 2008). Направени се обиди за подобрување на биосинтезата на биосурфактанти (сурфактанти) преку оптимизирање на соевите и ферментацијата. Сепак, титарот на сурфактантот во медиумот за култура е низок (1,0 g/L), што претставува предизвик за производство на големо (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Затоа, методите на генетско инженерство се користат за подобрување на неговата биосинтеза. Сепак, неговата инженерска модификација е тешка поради големата големина на оперонот (∼25 kb) и сложената биосинтетска регулација на системот за кворум сензори (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Кај бактериите Bacillus се спроведени голем број модификации на генетски инженеринг, главно насочени кон зголемување на производството на сурфактин со замена на промотерот (srfA оперон), прекумерно експресирање на протеинот за извоз на сурфактин YerP и регулаторните фактори ComX и PhrC (Jiao et al., 2017). Сепак, овие методи на генетски инженеринг постигнале само една или неколку генетски модификации и сè уште не достигнале комерцијално производство. Затоа, потребно е понатамошно проучување на методите за оптимизација базирани на знаење.
Студиите за биоразградба на PAH главно се спроведуваат под стандардни лабораториски услови. Сепак, на контаминирани места или во контаминирани средини, покажано е дека многу абиотски и биотски фактори (температура, pH, кислород, достапност на хранливи материи, биорасположивост на супстратот, други ксенобиотици, инхибиција на крајниот производ итн.) ја менуваат и влијаат врз деградативната способност на микроорганизмите.
Температурата има значително влијание врз биоразградбата на PAH. Со зголемувањето на температурата, концентрацијата на растворен кислород се намалува, што влијае на метаболизмот на аеробните микроорганизми, бидејќи тие бараат молекуларен кислород како еден од супстратите за оксигеназите кои вршат реакции на хидроксилација или расцепување на прстенот. Често се забележува дека покачената температура ги претвора родителските PAH во потоксични соединенија, со што се инхибира биоразградбата (Muller et al., 1998).
Забележано е дека многу места контаминирани со PAH имаат екстремни pH вредности, како што се местата контаминирани со кисела дренажа на рудници (pH 1–4) и местата за гасификација на природен гас/јаглен контаминирани со алкален исцедок (pH 8–12). Овие услови можат сериозно да влијаат на процесот на биоразградување. Затоа, пред да се користат микроорганизми за биоремедијација, се препорачува да се прилагоди pH вредноста со додавање соодветни хемикалии (со умерен до многу низок потенцијал за оксидациско-редуцирање) како што се амониум сулфат или амониум нитрат за алкални почви или варење со калциум карбонат или магнезиум карбонат за кисели места (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
Снабдувањето со кислород во засегнатата област е фактор што ја ограничува брзината на биоразградување на PAH. Поради редокс условите на животната средина, процесите на биосанација in situ обично бараат воведување на кислород од надворешни извори (орање, прскање со воздух и додавање хемикалии) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) покажаа дека додавањето на магнезиум пероксид (соединение што ослободува кислород) во контаминиран водоносен слој може ефикасно да ги биосанира BTEX соединенијата. Друга студија ја истражуваше in situ деградацијата на фенол и BTEX во контаминиран водоносен слој со инјектирање на натриум нитрат и изградба на бунари за екстракција за да се постигне ефикасна биосанација (Bewley and Webb, 2001).