Сегашно†Тековна адреса: OX11 0DE, Велика Британија, Дајмонд Билдинг, Харвел Научен и Иновациски Парк, Диткот, Оксфордшир, Велика Британија, Diamond Light Source Co., Ltd., Центар за електронско биолошко снимање.
Комплексот 1 за собирање светлина во реакцискиот центар (RC-LH1) е основната фотосинтетска компонента на виолетовите фототрофни бактерии. Воведовме две крио-електронски микроскопски структури на комплексот RC-LH1 од Rhodopseudomonas palustris. Структурата со резолуција од 2,65-Å на комплексот RC-LH114-W се состои од 14 јамки на LH1 подгрупи што го опкружуваат RC, кој е прекинат од протеин W, додека комплексот без протеин-W е целосно во составот на RC опкружен со RC. Затворена јамка на LH1 со 16 подгрупи. Споредбата на овие структури дава увид во динамиката на хинонот во комплексот RC-LH1, вклучувајќи ги претходно неодредените конформациски промени при врзување на хинонот на местото RC QB, како и локацијата на помошните места за врзување на хинонот, кои помагаат во нивното пренесување до RC. Уникатната структура на протеинот W го спречува затворањето на јамката LH1, со што се создава канал за забрзување на размената хинон/хинолон.
Енергијата обезбедена со фотосинтезата може да го одржи речиси целиот живот на Земјата и има голем потенцијал за сончева биотехнологија. Додека ја промовираат глобалната фотосинтеза, виолетовите фототрофни бактерии, исто така, покажуваат различни енергетски режими и метаболички способности. Тие можат да ја избегнат фотосинтезата и да растат како хетеротрофни бактерии во темнина, можат да го фиксираат азот и јаглерод диоксидот, да произведуваат водород и да ги разградуваат ароматичните соединенија (1-3). За да се обезбеди енергија за овие процеси, светлината мора брзо и ефикасно да се претвори во хемиска енергија. Овој процес започнува кога комплексот на антената што ја заробува светлината ја апсорбира светлината и ја пренесува заробената енергија во реакцискиот центар (RC), со што започнува раздвојувањето на полнежот (4-7). Основната единица на фотосинтезата кај виолетовите фототрофни бактерии е составена од RC тип 2, опкружена со комплекс 1 што ја собира светлината (LH1), формирајќи го основниот комплекс RC-LH1. LH1 е формиран од низа закривени αβ хетеродимери, од кои секој врзува два молекули на бактериски хлорофил (BChl)α и еден или два каротеноиди (8-12). Наједноставната LH1 антена се состои од 16 или 17 αβ хетеродимери кои го опкружуваат RC (9-13) во затворена јамка, но во други јадрени комплекси, трансмембранските пептиди го прекинуваат континуитетот на околниот LH1, со што се промовира дифузијата на хинол/хинон помеѓу RC и комплексот цитохром bc1 (11, 13-15). Виолетовото фототрофно растение Rhodopseudomonas (Rps.) е модел организам кој може да го разбере преносот на енергија и електрони што ја поддржува фотосинтезата. Првата кристална структура на Rps. Моделот на комплексот palustris RC-LH1 е RC, опкружен со 15 хетеродимерни LH1 јамки, кои се прекинати од непознат протеин наречен „Протеин W“ (14). Протеинот-W последователно беше идентификуван како RPA4402, што е некарактеризиран протеин од 10,5kDa со три предвидени трансмембрански спирали (TMH) (16). Предлагаме да го преименуваме генот rpa4402 што го кодира протеинот W во pufW за да биде во согласност со номенклатурата што се користи за гени што ги кодираат RC-L, M (pufL, pufM) и LH1α, β (pufA, pufB) подгрупи. Интересно е што протеинот-W е присутен само во околу 10% од RC-LH1, што открива дека Rps. palustris произведува два различни RC-LH1 комплекси. Овде, ги објавуваме високорезолуционите крио-EM (крио-EM) структури на два основни комплекси, едниот со протеин W и 14 αβ хетеродимери, другиот без протеин W и затворена 16 хетеродимерна LH1 јамка. Нашата структура претставува чекорна промена во разбирањето на RC-LH1 комплексот на Rps. palustris, бидејќи ја анализиравме хомогената популација на секоја варијанта и имаме доволна резолуција за јасно да ги доделиме секој пептид и врзани пигменти и сродни липиди и хинони. Споредбата на овие структури покажува дека трите TMH протеини-W кои досега не се пронајдени во ниту еден друг RC-LH1 комплекс генерираат хинонски канал за да ја забрзаат размената на хинон/хинолон. Идентификувани се голем број конзервирани места за врзување на липиди и хинони, а откривме и нова конформациска промена по комбинацијата на хинон и RC, што може да биде погодно за RC на фотосистемот II (PSII) на оксигенирани фототрофни организми. Нашите наоди даваат нов увид во кинетиката на врзувањето и размената на хинон/хинолон во основниот комплекс RC-LH1 на виолетови фототрофни бактерии.
За да се олесни деталната студија на двата комплекса пронајдени во Rps. palustris, го изолиравме секој RC-LH1 со биохемиски методи. Комплексот со недостаток на протеин W (во понатамошниот текст ΔpufW) беше прочистен од сојот на кој му недостасува генот pufW (16), и може да се произведе само еден RC-LH1 комплекс. Комплексот што содржи протеин W е произведен од сој. Протеинот W од овој сој е модифициран со 10x His ознака на неговиот C-терминал, така што комплексот што содржи протеин W може ефикасно да се комбинира со повеќето на кои им недостасува протеин W со имобилизирање на метал. Комплексот е ефикасно одвоен (16) со афинитетна хроматографија (IMAC).
Како што е прикажано на Слика 1, двата комплекса содржат три подединици RC (RC-L, RC-M и RC-H) опкружени со LH1 антена. Структурата од 2,80-A на комплексот на кој му недостасува протеин-W покажува 16 αβ хетеродимери, формирајќи затворена LH1 јамка целосно околу RC, во понатамошниот текст наречен комплекс RC-LH116. Структурата од 2,65 Å на комплексот што содржи протеин-W има 14-хетеродимер LH1 прекинат од протеин-W, во понатамошниот текст наречен RC-LH114-W.
(A и B) Површинска репрезентација на соединението. (C и D) Сврзани пигменти изразени во прачки. (E и F) Комплексите набљудувани од цитоплазматската површина ги имаат пептидите и LH1 подгрупите претставени во цртани филмови и се нумерирани во насока на стрелките на часовникот од јазот протеин-W [во согласност со нумерирањето Rba. комплекс sphaeroides (13)]. За LH1-α, бојата на протеинската подгрупа е жолта; за LH1-β, бојата на протеинската подгрупа е сина; за протеин-W, протеинот е црвена; за RC-H, таа е цијан; за RC-L, таа е портокалова; за RC-M, магента. Кофакторите се претставени со прачки, зелената ги претставува молекулите BChl и BPha, виолетовата ги претставува каротеноидите, а жолтата ги претставува молекулите UQ10. (G и H) Зголемен поглед на јазот протеин-W во еквивалентниот регион на комплексот RC-LH114-W (G) и комплексот RC-LH116 (H). Кофакторите се прикажани во форма на пополнување на простор, хелатниот хинон е прикажан во сина боја. Јазот протеин-W е обележан со сина испрекината линија во (G), а малите дупки каде што хинон/хинолол дифундира на прстенот LH116 се обележани со црна испрекината линија во (H).
Слика 1 (A и B) го прикажува RC опкружен со отворени или затворени низи од LH1αβ хетеродимери, од кои секој врзува два BChl и еден каротеноид (Слика 1, C и D). Претходни студии покажаа дека Rps е LH1 комплексот. Во биосинтетскиот пат на спирулина ксантин, овие видови содржат мешани популации на каротеноиди (17). Сепак, спиропироксантинот е доминантен каротеноид и неговата густина е задоволителна. Затоа, избравме да го моделираме спироксантинот на сите места за врзување на LH1. Алфа и бета полипептидите се единечни TMH со кратки мембрански надворешни региони (Слика 1, A, B, E и F). Иако густината од 17 остатоци на C-терминалот не беше забележана, алфа полипептидот беше расцепен од Met1 до Ala46 во двата комплекса. β полипептидот беше редуциран од Gly4 до Tyr52 во RC-LH116 и од Ser5 до Tyr52 во RC-LH114-W. Не е забележана густина од 3 или 4 N-терминални или 13 C-терминални остатоци (Слика S1). Анализата со масена спектрометрија на мешаниот RC-LH1 комплекс подготвен од сојот од див тип покажа дека недостасувачкиот регион е резултат на хетерологно расцепување на овие пептиди (Слика S1 и S2). Исто така, е забележана и N-терминална формалација на α-Met1 (f). Анализата покажа дека α-пептидот се состои од остатоци fMet1 до Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, а β-пептидот се состои од остатоци Ser2 до Ala53, што е во добра согласност со мапата на густина на EM на ниска температура.
Координацијата на α-His29 и β-His36 ги прави BChl-овите лице в лице; секој αβ хетеродимер се составува со своите соседи за да формира отворена јамка (RC-LH114-W) или затворена јамка (RC-LH116) околу RC низата пигменти поврзани со екситон (Слика 1, C и D). Во споредба со опсегот од 877 nm на RC-LH114-W, поместувањето на апсорпционото црвено од 880 nm на RC-LH116 е 3 nm (Слика 2A). Сепак, спектарот на кружен дихроизам е речиси ист (Слика 2B), што укажува дека иако постои јасна разлика помеѓу отворените и затворените јамки, локалната средина на BChl-овите е многу слична. Поместувањето на апсорпционото црвено може да биде резултат на намалено термичко движење и зголемена стабилност на затворената јамка (18, 19), промената во спојувањето на пигментите предизвикана од затворената јамка (20, 21) или комбинација од овие два ефекта (11).
(A) Спектар на апсорпција на ултравиолетово/видливо/блиско-инфрацрвено зрачење, чии врвови се обележани со нивните соодветни пигменти и нормализирани на врвот BPh на 775 nm. (B) Спектар на кружен дихроизам нормализиран на апсорпцијата на BChl на 805 nm. (C и D) Избрани ΔA спектри од временски разрешените спектри на апсорпција на комплексот RC-LH114-W (C) и комплексот RC-LH116 (D). За подобра споредливост, сите спектри се нормализирани на ΔA од −A на 0,2 ps. (E) Стапката на оксидација на цитохром c2 по зрачење во присуство на различни концентрации на UQ2 (видете ја Слика S8 за сурови податоци). (F) Во клетки одгледувани под светлина со низок, среден или висок интензитет (10, 30 или 300μMm-2 s-1, соодветно), протеинските подгрупи W и RC-L во прочистениот комплекс и односот на одвоената мембрана. Определете го нивото на протеини со електрофореза на SDS-полиакриламид гел и имунотест (видете ја Слика S9 за сурови податоци). Определете го односот во однос на прочистениот комплекс RC-LH114-W. Стехиометрискиот однос на RC-L кон протеинот-W од комплексот е 1:1.
BChl-овите на позиција 1 во деформираната αβ14 јамка на RC-LH114-W (Слика 1, A, C и E) се поблиску до примарниот донор на RC (P) за 6,8 Å отколку еквивалентните BChl-ови во RC-LH116 (Слика 1, B, D и F и Слика S3); сепак, кинетиката на минлива апсорпција на двата комплекса покажува дека за RC-LH114-W и RC-LH116, константите на времето на пренос на енергијата на побудување од LH1 до RC се 40 ± 4 и 44 ± 3 ps (Слика 2). , C и D, Слика S4 и Табела S2). Исто така, нема значајна разлика во електронскиот пренос во рамките на RC (Слика S5 и поврзан дополнителен текст). Претпоставуваме дека блиската кореспонденција на времето на пренос на енергија помеѓу LH1 и RC-P се должи на сличното растојание, агол и потенцијална енергија на повеќето BChl во двете LH1 јамки. Се чини дека истражувањето на енергетскиот модел на LH1 за да се достигне минималното растојание не е побрзо од директниот пренос на енергија од неоптимални места до RC. Јамката LH1 со отворена јамка во RC-LH114-W може да претрпи и незначително термичко движење под услови на ниска температура за структурна анализа, а постои и подолга конформација на прстенот αβ14 на собна температура од растојанието на пигментација на βBChls на позицијата на RC 1.
Комплексот RC-LH116 содржи 32 BChl и 16 каротеноиди, а неговиот целокупен распоред е ист како оној добиен од Thermochromatium (Tch.) piddipudum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), сојот Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) и зелените алги (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). По усогласувањето, беа забележани само мали отстапувања во позициите на αβ хетеродимерите, особено 1-5, 15 и 16 (Слика S6). Присуството на протеин-W има значително влијание врз структурата на LH1. Неговите три TMH се поврзани со кратки јамки, со N-терминалот на луменската страна на комплексот и C-терминалот на цитоплазматската страна (Слики 1А и 3, од А до D). Протеинот-W е во голема мера хидрофобен (Слика 3B), а TMH2 и TMH3 реагираат со LH1αβ-14 за да формираат трансмембранска површина (Слика 3, B и E до G). Интерфејсот е главно составен од Phe, Leu и Val остатоци во трансмембранскиот регион. Овие остатоци се наредени со хидрофобни аминокиселини и αβ-14 пигменти. Некои поларни остатоци, исто така, придонесуваат за интеракцијата, вклучувајќи ја водородната врска помеѓу W-Thr68 и β-Trp42 на површината на комплексната празнина (Слика 3, F и G). На површината на цитоплазмата, Gln34 е во непосредна близина на кето групата на αβ-14 каротеноиди. Покрај тоа, молекулата на n-додецил β-d-малтозид (β-DDM) беше разделена, а нејзината хидрофобна опашка се прошири до интерфејсот помеѓу протеинот-W и αβ-14, а липидната опашка може да се наоѓа во телото. Исто така, забележавме дека регионите за резолуција на C-терминалниот дел од протеинот W и RCH се многу блиски, но не се во опсегот на формирање специфични интеракции (Слика 1, A и E). Сепак, може да има интеракции во нерешените C-терминални аминокиселини на овие два протеини, што може да обезбеди механизам за регрутирање на протеинот-W за време на склопувањето на комплексот RC-LH114-W.
(A) Протеинот-W, кој е свртен кон интерфејсот со LH1αβ14 во картонска форма, има страничен ланец во форма на прачка (црвена), прикажан во дел од дијаграмот на електростатскиот потенцијал (проѕирна сива површина со ниво на контура од 0,13). (B) Протеинот-W претставен со хидрофобна обоена површина. Поларните и наелектризираните области се прикажани во цијан, хидрофобните области се прикажани во бела боја, а силно хидрофобните области се прикажани во портокалова боја. (C и D) Протеинот-W претставен во картонска боја, неговата ориентација е иста како во (A) (C) и ротиран за 180° (D). Според позицијата во низата, препознатливите остатоци прифаќаат шема на бои на виножитото, каде што N-терминалот е син, а C-терминалот е црвен. (E) Протеинот-W во истиот поглед како во (A), а остатоците на интерфејсот на протеинот-W:LH1 се претставени со прачки со прикачени ознаки. (F) Протеинот-W е ротиран за 90° во однос на (E) и LH1αβ14 во цртаната претстава, и во однос на остатоците од интерфејсот во лентната претстава. Надвиснатите остатоци од бета полипептидот се обележани. Кофакторот е прикажан како лента што одговара на бојата на Слика 1, разградениот β-DDM е прикажан во сива боја, а кислородот е прикажан во црвена боја. (G) Приказот во (F) е ротиран за 180°, со истакнати остатоци од обележаниот алфа полипептид.
Протеинот-W заменува еден αβ хетеродимер (15-тиот на Слика 1F), со што се спречува затворање на јамката и навалување на првите три αβ хетеродимери. Беше забележано дека максималниот агол на наклон на првиот αβ-1 хетеродимер во однос на нормалата на филмот беше од 25° до 29° (Слика 1, A и E), што беше формирано со наклонот од 2° до 8° на αβ-1 во RC A со остар контраст-LH116 (Слика 1, B и F). Вториот и третиот хетеродимер се наклонети на 12° до 22° и 5° до 10°, соодветно. Поради стеричната пречка на RC, наклонот на αβ-1 не го вклучува вториот пар на αβ (што одговара на 16-тиот αβ на Слика 1F), со што се формира јасна празнина во прстенот LH1 (Слика 1, A и E). Поради недостатокот на два αβ хетеродимери, придружен со губење на четири BChl и два каротеноиди, ниту еден од каротеноидите не се врзува за извитканата αβ-1 подгрупа, што резултира со LH114-W прстен што содржи 13 каротеноиди вегетаријанци и 28 BChl. Проценките за локална резолуција на двата комплекси во регионите од αβ1 до 7 се пониски од оние на остатокот од LH1 јамката, што може да ја одразува вродената пластичност на LH1 подгрупата во непосредна близина на RC QB местото (Слика 4).
Сликите од RC-LH114-W (A и B) и RC-LH116 (C и D) се прикажани од истиот поглед од горе/страничен поглед (A и B) (A и C) и површината на шуплината на Сл. 1. (B и D). Обоените копчиња се прикажани од десно.
Единствениот друг карактеристичен јадрен комплекс со стехиометриски сооднос од 1:14 е димерот RC-LH1-PufX од Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Сепак, протеинот W и PufX немаат очигледна хомологија и имаат значително влијание врз нивните соодветни LH1 структури. PufX е единечен TMH со N-терминален цитоплазматски домен кој комуницира со цитоплазматската страна на RC-H подгрупата (13) на позиција што одговара на Rps. palustris LH116αβ-16. PufX создава канал за размена на хинон/хинолон помеѓу RC-LH1 и цитохром bcl комплексот и е присутен во целиот јадрен комплекс Rba. sphaeroides (13). Иако интерфејсот мономер-мономер е во Rba. Димерот sphaeroides RC-LH1-PufX се наоѓа на позицијата на врзување на протеинот W во RC-LH114-W, а јазот предизвикан од PufX и протеинот-W е на еквивалентна позиција (Слика S7A). Јазот во RC-LH114-W е исто така усогласен со хипотетичкиот хинонски канал (8) на Pseudomonas rosea LH1, кој е формиран од пептиди кои не се поврзани со протеинот W или PufX (Слика S7B). Покрај тоа, хинонскиот канал во Blc. Смарагдно зелениот LH1 формиран со исклучување на една γ подединица (7) се наоѓа на слична позиција (Слика S7C). Иако е посредувано од различни протеини, појавата на овие канали хинон/хинолол во заедничка позиција во комплексот RC-LH1 се чини дека е пример за конвергентна еволуција, што укажува дека јазот создаден од протеинот W може да дејствува како хинонски канал.
Јазот во јамката LH114-W овозможува формирање на континуиран мембрански регион помеѓу внатрешниот простор на комплексот RC-LH114-W и мембраната (Слика 1G), наместо поврзување на двата домени преку протеинска пора како кај протеините. Комплексот RC-LH116 е сличен на затворен комплекс Tch. како игла (22) (Слика 1H). Бидејќи дифузијата на хинон низ мембраната е побрза од дифузијата низ тесниот протеински канал, отворената јамка LH114-W може да овозможи побрз RC промет отколку затворената јамка LH116, а дифузијата на хинон во RC може да биде поограничена. За да тестираме дали протеинот W влијае на конверзијата на хиноните преку RC, извршивме тест за оксидација на цитохром на одредена концентрација на убихинон 2 (UQ2) (аналог на природниот UQ10 со пократка изопренска опашка) (Слика 2E). Иако присуството на хелиран хинон го попречува точното одредување на очигледната Михаелисова константа (RC-LH114-W и RC-LH116 се погодни за 0,2 ± 0,1 μM и 0,5 ± 0,2 μM, соодветно), максималната брзина на RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) е за 28 ± 5% поголема од RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Првично проценивме дека протеинот-W е присутен во околу 10% од основниот комплекс (16); тука, стапките на зафатеност на клетките за раст со слаба светлина, средна светлина и силна светлина се 15 ± 0,6%, 11 ± 1% и 0,9 ± 0,5, соодветно % (Слика 2F). Квантитативната споредба на масената спектрометрија покажа дека додавањето на хистидинска ознака не го намали релативното изобилство на протеин-W во споредба со соевите од див тип (P = 0,59), така што овие нивоа не се артефакт на модифициран протеин-W (Слика S10). Сепак, оваа ниска зафатеност на протеин-W во комплексот RC-LH1 може да им овозможи на некои RC да се превртуваат со забрзана брзина, со што се ублажува побавната размена на хинон/хинолон во комплексот RC-LH116. Забележавме дека високата стапка на зафатеност со светлина е неконзистентна со неодамнешните податоци од транскриптомијата, што укажува дека експресијата на генот pufW се зголемува под силна светлина (Слика S11) (23). Разликата помеѓу транскрипцијата на pufW и инкорпорацијата на протеинот-W во комплексот RC-LH1 е збунувачка и може да ја одразува комплексната регулација на протеинот.
Во RC-LH114-W, 6 кардиолипини (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерол (POPG) и 29 β-DDM молекули се алоцирани и моделирани во него 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG и 12 βDDM. RC-LH116 (Слика 5, А и Б). Во овие две структури, CDL е речиси лоциран на цитоплазматската страна од комплексот, додека POPC, POPG и β-DDM се претежно лоцирани на луминалната страна. Две липидни и детергентски молекули беа изолирани во регионот αβ-1 до αβ-6 на комплексот RC-LH114-W (Слика 5А), а пет беа изолирани во еквивалентниот регион на RC-LH116 (Слика 5Б). Повеќе липиди беа пронајдени на другата страна од комплексот, главно CDL, акумулирани помеѓу RC и αβ-7 до αβ-13 (Слика 5, A и B). Други структурно растворени липиди и детергенти се наоѓаат надвор од LH1 прстенот, а добро растворените ацилни ланци се протегаат помеѓу LH1 подгрупите, привремено означени како β-DDM во RC-LH114-W, и дефинирани како β-DDM во RC. Мешавина од β-DDM и POPC-LH116. Сличните позиции на хелатните липиди и детергенти во нашата структура укажуваат дека тие се физиолошки релевантни места на врзување (Слика S12A). Позициите на еквивалентните молекули во Tch исто така имаат добра конзистентност. Gentle и Trv. Сојот 970 RC-LH1s (Слика S12, B до E) (9, 12) и остатоците од водородни врски на липидната главна група покажаа прилично добра конзервација во усогласувањето на секвенците (Слика S13), што укажува дека е конзервиран CDL кој се врзува за RC (24), овие места може да бидат конзервирани во комплексот RC-LH1.
(A и B) Пептидите RC-LH114-W (A) и RC-LH116 (B) се претставени со цртани филмови, а пигментите се претставени со прачки, користејќи ја шемата на бои на Слика 1. Липидите се прикажани со црвена боја, а детергентите се прикажани со сива боја. UQ врзан за местата RC QA и QB е жолт, додека изолираниот UQ е сино. (C и D) Исти погледи како (A) и (B), со изоставени липиди. (E до G) Зголемен поглед на Q1(E), Q2(F) и Q3(G) од RC-LH116, со странични ланци кои влијаат едни на други. Водородните врски се прикажани како црни испрекинати линии.
Во RC-LH116, и RC QA и QB UQ, кои учествуваат во преносот на електрони во процесот на раздвојување на полнежот, се разградуваат во нивните места на врзување. Сепак, во RC-LH114-W, QB хинонот не е решен и ќе биде детално разгледан подолу. Покрај QA и QB хиноните, две хелирани UQ молекули (лоцирани помеѓу прстените RC и LH1) се распределени во структурата RC-LH114-W според нивните добро релизирани главни групи (лоцирани во Q1 и Q2, соодветно). простор). Слика 5C). Две изопренски единици се доделени на Q1, а мапата на густина ги разложува комплетните 10 изопренски опашки на Q2. Во структурата на RC-LH116, три хелирани UQ10 молекули (Q1 до Q3, Слика 5D) беа разделени, и сите молекули имаат јасна густина низ целата опашка (Слика 5, од D до G). Во двете структури, позициите на хинонските главни групи на Q1 и Q2 имаат одлична конзистентност (Слика S12F), и тие комуницираат само со RC. Q1 се наоѓа на влезот од W јазот на RC-LH114-W (Слика 1G и 5, C, D и E), а Q2 се наоѓа во близина на местото на врзување на QB (Слика 5, C, D) и F). Конзервираните остатоци од L-Trp143 и L-Trp269 се многу блиску до Q1 и Q2 и обезбедуваат потенцијални π-стекинг интеракции (Слика 5, E и F, и Слика S12). L-Gln88, оддалечен 3,0 Å од дисталниот кислород на Q1, обезбедува силна водородна врска (Слика 5E); овој остаток е конзервиран во сите RC освен во најоддалечената врска (Слика S13). L-Ser91 е конзервативно заменет за Thr во повеќето други RC (Слика S13), е оддалечен 3,8 ангстреми од метил кислородот на Q1 и може да обезбеди слаби водородни врски (Слика 5E). Се чини дека Q3 нема специфична интеракција, но се наоѓа во хидрофобниот регион помеѓу RC-M подгрупата и LH1-α подгрупата 5 до 6 (Слика 5, D и G). Q1, Q2 и Q3 или блиските хелатирани хинони се исто така разложени во Tch. Gentle, Trv. Strain 970 и Blc. Структурата на ирисот (9, 10, 12) укажува на конзервирано помошно место за врзување на хинон во комплексот RC-LH1 (Слика S12G). Петте разложени UQ во RC-LH116 се во добра согласност со 5,8 ± 0,7 од секој комплекс определен со високо-перформансна течна хроматографија (HPLC), додека трите разложени UQ во RC-LH114-W се пониски од. Измерената вредност од 6,2 ± 0,3 (Сл. S14) покажува дека во структурата има нерешени UQ молекули.
Псевдосиметричните L и M полипептиди содржат по пет TMH и формираат хетеродимер кој комбинира еден BChl димер, два BChl мономери, два бактериофагни (BPh) мономери и еден нехем железо и еден или два UQ10 молекули. Преку присуството на водородни врски на терминалната кетонска група и нејзината позната акумулација во Rps, каротеноидите се инкорпорирани во M-подгрупата, која се нарекува cis-3,4-дехидроорходопин. Видови (25). Доменот на надворешната мембрана на RC-H е закотвен за мембраната со еден TMH. Целокупната RC структура е слична на трите подгрупи RC на сродни видови (како што е Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Макроциклите на BChl и BPh, каротеноидниот 'рбет и нехем железото се преклопуваат во опсегот на резолуција на овие структури, како и главната група UQ10 на QA местото и QB хинонот на RC-LH116 (Слика S15).
Достапноста на две RC структури со различни стапки на зафатеност на QB местата дава нова можност да се испитаат конзистентните конформациски промени што го придружуваат врзувањето на QB хинонот. Во комплексот RC-LH116, QB хинонот се наоѓа во целосно врзана „проксимална“ позиција (26), но одвојувањето на RC-LH114-W нема QB хинон. Нема QB хинон во RC-LH114-W, што е изненадувачки бидејќи комплексот е активен, повеќе од комплексот RC-LH116 со структурно решен QB хинон. Иако двата LH1 прстени хелираат околу шест хинони, пет се структурно решен во затворениот RC-LH116 прстен, додека само три се структурно ограничени во отворениот RC-LH114-W прстен. Ова зголемено структурно нарушување може да ја одразува побрзата замена на QB местата RC-LH114-W, побрзата кинетика на хинонот во комплексот и зголемената веројатност за преминување на LH1 јамката. Сугерираме дека недостатокот на UQ на RC QB местото на RC-LH114-W може да биде резултат на посложен и поактивен комплекс, а QB местото на RC-LH114-W веднаш е замрзнато во UQ turnover. Специфичната фаза (влезот на QB местото е затворен) ја одразува конформацијата на оваа активност.
Без QB, придружната ротација на L-Phe217 во позиција што е некомпатибилна со врзувањето на UQ10, бидејќи ќе предизвика просторен судир со првата изопренска единица на опашката (Слика 6A). Покрај тоа, очигледните главни конформациски промени се очигледни, особено хеликсот de (кратка хеликс во јамката помеѓу TMH D и E) каде што L-Phe217 е поместен кон џебот за врзување на QB и ротацијата на L-Tyr223 (Слика 6A) за да се раскине водородната врска со рамката M-Asp45 и да се затвори влезот на местото за врзување на QB (Слика 6B). Хеликсот de се врти во својата база, Cα на L-Ser209 е поместен за 0,33 Å, додека L-Val221Cα е поместен за 3,52 Å. Нема видливи промени во TMH D и E, кои се суперимпозирачки во обете структури (Слика 6A). Колку што ни е познато, ова е првата структура во природниот RC што го затвора QB местото. Споредбата со целосната (QB-врзана) структура покажува дека пред да се редуцира хинонот, потребна е конформациска промена за да влезе во хинонот. L-Phe217 ротира за да формира π-стекинг интеракција со главната група на хинонот, а спиралата се поместува нанадвор, дозволувајќи им на скелетот на L-Gly222 и страничниот ланец на L-Tyr223 да формираат мрежа на водородни врски со стабилна структура на водородни врски (Слика 6, A и C).
(A) Преклопувачки цртан лик на холограм (L синџир, портокалов/M синџир, магента) и апо (сива) структура, во кој клучните остатоци се прикажани во форма на стапчеста претстава. UQ10 е претставен со жолта лента. Испрекинатата линија ги означува водородните врски формирани во целата структура. (B и C) Површинска претстава на аполипопротеинот и целата прстенеста структура, со што се истакнува страничниот синџир на кислород на L-Phe217 во сина боја и L-Tyr223 во црвена боја, соодветно. L подгрупата е портокалова; M и H подгрупите не се обоени. (D и E) Аполипопротеин (D) и цели (E) RC QB места [обојување според (A) соодветно] и Thermophilus thermophilus PSII (зелена, сина со пластичен хинон; PDB ID: 3WU2) Порамни (58).
Неочекувано, иако се достапни неколку структури на QB-дефицитарни RC без LH1, конформациските промени забележани во оваа студија не се претходно објавени. Тие вклучуваат структура на осиромашување на QB од Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) и Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), сите од кои се скоро исти како нивната целокупна QB структура. Деталната проверка на 3PRC покажа дека молекулите на детергент LDAO (лаурил диметил амин оксид) се врзуваат на влезот од QB позицијата, што може да спречи преуредување во затворена конформација. Иако LDAO не се распаѓа на истата позиција во 1EYS или 1OGV, овие RC се подготвуваат со користење на истиот детергент и затоа може да го произведат истиот ефект. Кристалната структура на Rba. Sphaeroides RC кокристализиран со цитохром c2 (PDB ID: 1L9B) исто така се чини дека има затворено QB место. Меѓутоа, во овој случај, N-терминалниот регион на RC-M полипептидот (во интеракција со QB местото на врзување преку H врската на остатокот Tyr на Q спиралата) усвојува неприродна конформација, а конформациската промена на QB не е дополнително истражена (30). Она што е смирувачко е што не сме виделе ваков вид деформација на M полипептидот во структурата RC-LH114-W, која е скоро иста како и N-терминалниот регион на RC-LH116 RC. Исто така, треба да се напомене дека по искоренувањето на LH1 антената базирана на детергент, аполипопротеинските RC во PDB беа разделени, со што се елиминираа внатрешните базени на хинони и липиди во јазот помеѓу RC и внатрешната површина на околниот LH1 прстен (31, 32). RC останува функционален бидејќи ги задржува сите кофактори, освен разградливиот QB хинон, кој е помалку стабилен и често се губи за време на процесот на подготовка (33). Покрај тоа, познато е дека отстранувањето на LH1 и природните циклични липиди од RC може да има влијание врз функциите, како што е скратениот животен век на P+QB-состојбата одвоена со полнеж (31, 34, 35). Затоа, шпекулираме дека постоењето на локалниот LH1 прстен околу RC може да го одржи „затвореното“ QB место, со што ќе се зачува локалната средина во близина на QB.
Иако аполипопротеинот (без QB хинон) и целосната структура претставуваат само два моменти од промената на QB местото, наместо серија настани, постојат индикации дека врзувањето може да се блокира за да се спречи повторно врзување од страна на хидрохинон за да се инхибира инхибицијата на супстратот. Интеракцијата на хинолол и хинон во близина на QB местото на аполипопротеинот може да биде различна, што доведува до негово отфрлање од страна на RC. Долго време се претпоставува дека конформациските промени играат улога во врзувањето и редукцијата на хиноните. Способноста на замрзнатите RC да ги редуцираат хиноните по адаптација во темнина е нарушена (36); рендгенската кристалографија покажува дека ова оштетување се должи на тоа што QB хиноните се заробени во „дистална“ конформација околу 4,5 Å од активната проксимална позиција (26), 37). Претпоставуваме дека оваа дистална конформација на врзување е моментална слика од средната состојба помеѓу аполипопротеинот и структурата на целиот прстен, која следи по почетната интеракција со хинон и отворањето на QB местото.
RC тип II што се наоѓа во PSII комплексот на одредени фототрофни бактерии и цијанобактерии, алги и растенија има структурна и функционална конзервација (38). Структурното усогласување прикажано на Слика 6 (D и E) ја нагласува сличноста помеѓу PSII RC и QB местото на бактерискиот RC комплекс. Оваа споредба долго време е модел за проучување на тесно поврзаните системи на врзување и редукција на хинони. Претходните публикации сугерираа дека конформациските промени се придружени со PSII редукција на хинони (39, 40). Затоа, имајќи ја предвид еволутивната конзервација на RC, овој претходно незабележан механизам на врзување може да биде применлив и на QB местото на PSII RC кај оксигенирани фототрофни растенија.
Rps ΔpufW (необележана pufW делеција) и PufW-His (C-терминален 10x His-обележан протеин-W експресиран од природниот pufW локус). palustris CGA009 беше опишан во нашата претходна работа (16). Овие соеви и изогениот родител од див тип беа извадени од замрзнувачот со нанесување на мал број клетки на PYE (секои 5 g литар -1) (складирани во LB на -80 °C, кои содржат 50% (w/v) глицерол) протеин, екстракт од квасец и сукцинат) агар [1,5% (w/v)] плоча. Плочата беше инкубирана преку ноќ во темница на собна температура под анаеробни услови, а потоа осветлена со бела светлина (~50 μmolm-2 s-1) обезбедена од OSRAM 116-W халогени светилки (RS Components, UK) од 3 до 5 дена додека не се појави една колонија. Една колонија беше употребена за инокулирање на 10 ml M22+ медиум (41) дополнет со 0,1% (w/v) казаминокиселини (во понатамошниот текст M22). Културата беше одгледувана под услови на ниска содржина на кислород во темница на 34°C со тресење на 180 вртежи во минута во тек на 48 часа, а потоа 70 ml од културата беше инокулирана под истите услови во тек на 24 часа. Полуаеробна култура со волумен од 1 ml се користеше за инокулирање на 30 ml M22 медиум во универзално проѕирно стаклено шише со капак од 30 ml со навртување и озрачена со агитација (~50μmolm-2 s-1) во тек на 48 часа со стерилна магнетна стапче за мешање. Потоа 30 ml од културата беше инокулирана со околу 1 литар култура под истите услови, која потоа беше употребена за инокулирање на околу 9 литри култура осветлена на ~200 μmolm-2 s-1 во тек на 72 часа. Клетките беа собрани со центрифугирање на 7132 RCF во тек на 30 минути, ресуспендирани во ~10 ml од 20 mM tris-HCl (pH 8,0) и складирани на -20°C додека не бидат потребни.
По одмрзнувањето, додадете неколку кристали од деоксирибонуклеаза I (Merck, Велика Британија), лизозим (Merck, Велика Британија) и две таблети инхибитор на холоензим протеаза од Roche (Merck, Велика Британија) во ресуспендираните клетки. Во француска ќелија под притисок од 20.000 psi (Aminco, САД), клетките беа разбиени 8 до 12 пати. По отстранувањето на нескршените клетки и нерастворливите остатоци со центрифугирање на 18.500 RCF во тек на 15 минути на 4°C, мембраната беше таложена од пигментираниот лизат со центрифугирање на 113.000 RCF во тек на 2 часа на 43.000°C. Отфрлете ја растворливата фракција и ресуспендирајте ја обоената мембрана во 100 до 200 ml од 20 mM tris-HCl (pH 8,0) и хомогенизирајте додека нема видливи агрегати. Суспендираната мембрана беше инкубирана во 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, САД) што содржи 2% (w/v) β-DDM во тек на 1 час во темница на 4°C со нежно мешање. Потоа центрифугирајте на 70°C за да растворите 150.000 RCF на 4°C во тек на 1 час за да ги отстраните преостанатите нерастворливи материи.
Растворувачката мембрана од сојот ΔpufW беше нанесена на колона за размена на јони DEAE Sepharose од 50 ml со три волумени на колоната (CV) од врзувачкиот пуфер [20 mM tris-HCl (pH 8,0) што содржи 0,03% (w/v) β-DDM]. Измијте ја колоната со два CV врзувачки пуфери, а потоа измијте ја колоната со два врзувачки пуфери што содржат 50 mM NaCl. Комплексот RC-LH116 беше елуиран со линеарен градиент од 150 до 300 mM NaCl (во врзувачки пуфер) на 1,75 CV, а преостанатиот врзувачки комплекс беше елуиран со врзувачки пуфер што содржи 300 mM NaCl на 0,5 CV. Соберете го апсорпцискиот спектар помеѓу 250 и 1000 nm, задржете ја фракцијата со апсорпциски однос (A880/A280) поголем од 1 на 880 до 280 nm, разредете ја двапати во врзувачкиот пуфер и повторно употребете ја истата постапка на DEAE колоната. При прочистување. Разредете ги фракциите со односи A880/A280 поголеми од 1,7 и односи A880/A805 поголеми од 3,0, извршете ја третата рунда на јонска размена и задржете ги фракциите со односи A880/A280 поголеми од 2,2 и односи A880/A805 поголеми од 5,0. Делумно прочистениот комплекс беше концентриран до ~2 ml во центрифугален филтер Amicon со молекуларна тежина од 100.000 (MWCO) (Merck, Велика Британија) и натоварен на колона за исклучување на големина Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, САД) што содржи пуфер од 200 mM NaCl, а потоа елуиран во истиот пуфер на 1,5 CV. Соберете ги апсорпционите спектри на фракцијата за исклучување на големина и концентрирајте ги апсорпционите спектри со соодноси A880/A280 над 2,4 и соодноси A880/A805 над 5,8 до 100 A880 и веднаш употребете ги за подготовка или складирање на крио-TEM мрежа. Чувајте на -80°C додека не бидат потребни.
Растворувачката мембрана од сојот PufW-His беше нанесена на колона HisPrep FF Ni-NTA Sepharose од 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) што содржи 200 mM NaCl и 0,03% (w/w)) во IMAC пуфер (GE Healthcare). v) β-DDM]. Колоната беше измиена со пет CV IMAC пуфер, а потоа со пет CV IMAC пуфер што содржи 10 mM хистидин. Основниот комплекс беше елуиран од колоната со пет IMAC пуфери што содржат 100 mM хистидин. Фракцијата што го содржи комплексот RC-LH114-W е концентрирана до ~10 ml во мешан резервоар опремен со филтер Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), разредена 20 пати со врзувачки пуфер, а потоа додадена во 25 ml. Во колоната DEAE Sepharose, однапред се користат четири CV врзани за пуферот. Колоната се мие со четири CV врзувачки пуфери, потоа се елуира комплексот на осум CV на линеарен градиент од 0 до 100 mM NaCl (во врзувачки пуфер), а преостанатите четири CV содржат 100 mM врзувачки пуфер. Преостанатите комплекси елуирани на натриум хлорид во комбинација со односот A880/A280 повисок од 2,4 и односот A880/A805 повисок од 4,6 фракциите беа концентрирани до ~2 ml во центрифугален филтер Amicon 100,000 MWCO и наполнети со 1,5 CV IMAC однапред. Пуферирана колона со исклучување со големина Superdex 200 16/600 со балансиран пуфер, а потоа се елуира во истиот пуфер над 1,5 CV. Соберете ги апсорпционите спектри на фракциите со исклучување на големината и концентрирајте ги апсорпционите спектри со соодноси A880/A280 над 2,1 и соодноси A880/A805 над 4,6 до 100 A880, кои веднаш се користат за подготовка на замрзната TEM мрежа или се чуваат на -80°C додека не бидат потребни.
За подготовка на TEM мрежи со ниска температура беше користен потопувачки замрзнувач Leica EM GP. Комплексот беше разреден во IMAC пуфер до A880 од 50, а потоа 5 μl беа натоварени на новоиспразнета бакарна мрежа QUANTIFOIL 1.2/1.3 обложена со јаглерод (Agar Scientific, UK). Инкубирајте ја мрежата на 20°C и 60% релативна влажност 30 секунди, потоа оставете ја да се исуши 3 секунди, а потоа изгасете ја во течен етан на -176°C.
Податоците од комплексот RC-LH114-W беа снимени на eBIC (Електронски центар за био-сликање) (Британски дијамантски извор на светлина) со микроскоп Titan Krios, кој работи на забрзувачки напон од 300kV, со номинално зголемување од 130.000× и енергија од - Изберете јаз од 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum со K2 детектор за врв беше користен за снимање слики во режим на броење за собирање податоци. Калибрираната големина на пикселот е 1,048 Å, а брзината на доза е 3,83 e-Å-2s-1. Филмот беше собран за 11 секунди и поделен на 40 делови. Користете ја површината обложена со јаглерод за повторно фокусирање на микроскопот, а потоа соберете три филмови по дупка. Вкупно беа собрани 3130 филмови, со вредности на дефокусирање помеѓу -1 и -3μm.
Податоците за комплексот RC-LH116 беа собрани со користење на истиот микроскоп во Лабораторијата за биоструктура Астербери (Универзитет во Лидс, Велика Британија). Податоците беа собрани во режим на броење со зголемување од 130 k, а големината на пикселите беше калибрирана на 1,065 Å со доза од 4,6 e-Å-2s-1. Филмот беше снимен за 12 секунди и поделен на 48 делови. Вкупно беа собрани 3359 филмови, со вредности на дефокус помеѓу -1 и -3μm.
Целата обработка на податоци се извршува во цевководот Relion 3.0 (42). Користете Motioncorr 2 (43) за да го корегирате движењето на зракот со мерење на дозата, а потоа користете CTFFIND 4.1 (44) за да го одредите параметарот CTF (функција за пренос на контраст). Типични фотомикрографии по овие почетни фази на обработка се прикажани на Слика 2. S16. Шаблонот за автоматско селектирање се генерира со рачно селектирање на околу 250 пиксели од 1000 честички во рамка од 250 пиксели и без референтна дводимензионална (2D) класификација, со што се отфрлаат оние класификации кои исполнуваат контаминација на примерокот или немаат забележливи карактеристики. Потоа, автоматско селектирање беше извршено на сите микрофотографии, а RC-LH114-W беше 849.359 честички, а комплексот RC-LH116 беше 476.547 честички. Сите избрани честички поминале два круга на нереферентна 2D класификација, и по секое тестирање, честичките што ја исполнуваат јаглеродната област, контаминацијата на примерокот, немањето очигледни карактеристики или честичките што силно се преклопуваат се отфрлаат, што резултира со 772.033 (90,9%) и 359.678 (75,5%) честички се користат за 3D класификација на RC-LH114-W и RC-LH116, соодветно. Првичниот 3D референтен модел е генериран со користење на стохастичкиот метод на градиентно спуштање. Користејќи го почетниот модел како референца, избраните честички се класифицираат во четири категории во 3D. Користејќи го моделот во оваа категорија како референца, извршете 3D рафинирање на честичките во најголемата категорија, потоа користете го почетниот нископропусен филтер од 15 Å за да ја покриете површината на растворувачот, додадете 6 пиксели меки рабови и обработете ги пикселите за да ја корегирате функцијата за пренос на модулацијата на врвот Gatan K2 на горниот детектор. За податочниот сет RC-LH114-W, овој почетен модел беше модифициран со отстранување на силната густина на рабовите на маската (откачена од густината на основниот комплекс во UCSF Chimera). Добиените модели (резолуциите на RC-LH114-W и RC-LH116 се 3,91 и 4,16 Å, соодветно) се користат како референца за втората рунда на 3D класификација. Користените честички се групирани во почетната 3D класа и не содржат силна корелација со соседството. Преклопување или недостаток на очигледни структурни карактеристики. По втората рунда на 3D класификација, беше избрана категоријата со највисока резолуција [За RC-LH114-W, една категорија е 377.703 честички (44,5%), за RC-LH116, постојат две категории, со вкупно 260.752 честички (54,7%), каде што тие се исти само кога се порамнети по почетната ротација со мала разлика]. Избраните честички се реекстрактираат во кутија од 400 пиксели и се рафинираат со 3D рафинирање. Маската со растворувач се генерира со помош на почетниот нископропусен филтер од 15 Å, проширување на мапата од 3 пиксели и мека маска од 3 пиксели. Со помош на рафинирање на CTF по честичка, корекција на движење по честичка и втората рунда на рафинирање на CTF по честичка, 3D рафинирање, маскирање со растворувач и пост-обработка се изведуваат по секој чекор за понатамошно рафинирање на добиената текстура. Со помош на граничната вредност на FSC (коефициент на корелација на Фуриеова обвивка) од 0,143, резолуциите на конечните модели на RC-LH114-W и RC-LH116 се 2,65 и 2,80 Å, соодветно. FSC кривата на конечниот модел е прикажана на Слика 2. S17.
Сите протеински секвенци се преземени од UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) беше користен за конструирање на хомолошки модел на RC, кој ги содржи протеинските секвенци на RC-L, RC-M и RC-H, а кристалната структура на Rba.sphaeroides беше користена како шаблон (PDB ID: 5LSE) (46). Користете ја алатката „соодветна мапа“ во UCSF Chimera за да го прилагодите генерираниот модел на мапата (47), да ја подобрите структурата на протеините и кофакторот [4×BChl a (име на остаток од библиотеката на мономери = BCL), 2×BPh a (BPH), еден или два вида UQ10 (U10), едно нехемско железо (Fe) и еден 3,4-дихидрохексакарбонилхолин (QAK)], користете го Coot (48) за да го додадете. Бидејќи QAK не е достапен во библиотеката на мономери, тој беше параметризиран со помош на алатката eLOW во PHENIX (49).
Потоа, беше конструирана LH1 подгрупата. Првично, алатката за автоматска конструкција во PHENIX (49) беше користена за автоматско конструирање на дел од LH1 секвенцата користејќи ја мапата и LH1-α и LH1-β протеинските секвенци како влез. Изберете ја најкомплетната LH1 подгрупа, извлечете ја и вчитајте ја во Coot, рачно додадете ја недостасувачката секвенца во неа и рачно рафинирајте ја целата структура пред да додадете два BCls a (BCL) и спирилоксантин (CRT) [според релевантниот Rps густина на комплексот LH1 и познатата содржина на каротеноиди. Видови (17)]. Копирајте ја целата LH1 подгрупа и користете ја UCSF Chimera „Docking Map Tool“ за да ја прикачите во соседната немоделна област со густина на LH1, а потоа рафинирајте ја во Coot; повторете го процесот додека не се моделираат сите LH1 подгрупи. За структурата RC-LH114-W, со извлекување на нераспределената густина во Coot, протеинот се сегментира од преостанатите непротеински компоненти во мапата на USCF Chimera и алатката Autobuild се користи за воспоставување на почетниот модел и моделирање на преостанатите подединици (протеин-W). Во PHENIX (49). Додадете ги сите недостасувачки секвенци на добиениот модел во Coot (48), а потоа рачно рафинирајте ја целата подединица. Преостанатата нераспределена густина одговара на комбинацијата од липиди (PDB мономерна библиотека ID на CDL = CDL, POPC = 6PL и POPG = PGT), β-DDM детергент (LMT) и UQ10 молекули (U10). Користете ја оптимизацијата на PHENIX (49) и рачната оптимизација во Coot (48) за да го усовршите целиот почетен модел сè додека статистиката на моделот и визуелниот квалитет на вклопувањето не можат дополнително да се подобрат. Конечно, користете LocScale (50) за да ја изострите локалната мапа, а потоа извршете неколку други циклуси на моделирање на нераспределената густина и автоматска и рачна оптимизација.
Соодветните пептиди, кофактори и други липиди и хинони споени во рамките на нивните соодветни густини се прикажани на сликите 1 и 2. S18 до S23. Статистичките информации за конечниот модел се прикажани во Табела S1.
Освен ако не е поинаку наведено, UV/Vis/NIR апсорпционите спектри беа собрани на Cary60 спектрофотометар (Agilent, САД) во интервали од 1 nm од 250 nm до 1000 nm и време на интеграција од 0,1s.
Разредете го примерокот во кварцна кивета со патека од 2 mm до A880 од 1 и соберете го апсорпциониот спектар помеѓу 400 и 1000 nm. Кружните дихроични спектри беа собрани на спектрополариметар Jasco 810 (Jasco, Јапонија) во интервали од 1 nm помеѓу 400 nm и 950 nm со брзина на скенирање од 20 nm min-1.
Моларниот коефициент на екстинкција се одредува со разредување на основниот комплекс до A880 од приближно 50. Разредете го волуменот од 10 μl во 990 μl врзувачки пуфер или метанол и веднаш соберете го апсорпцискиот спектар за да се минимизира деградацијата на BChl. Содржината на BChl во секој примерок од метанол беше пресметана со коефициентот на екстинкција на 771 nm од 54,8 mM-1 cm-1, а коефициентот на екстинкција беше определен (51). Поделете ја измерената концентрација на BChl со 32 (RC-LH114-W) или 36 (RC-LH116) за да ја одредите концентрацијата на основниот комплекс, која потоа се користи за да се одреди апсорпцискиот спектар на истиот примерок собран во пуферот. Коефициент на екстинкција. паралелно. За секој примерок беа земени три повторени мерења, а просечната апсорпција на максимумот на BChl Qy беше искористена за пресметка. Коефициентот на екстинкција на RC-LH114-W измерен на 878 nm е 3280±140 mM-1 cm-1, додека коефициентот на екстинкција на RC-LH116 измерен на 880 nm е 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 беше квантифициран според методот во (52). Накратко, HPLC со обратна фаза (RP-HPLC) беше извршена со користење на HPLC системот Agilent 1200. Растворете околу 0,02 nmol RC-LH116 или RC-LH114-W во 50 μl метанол:хлороформ 50:50 што содржи 0,02% (w/v) железен хлорид и инјектирајте го претходно избалансираниот Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Растворете во 1 ml-1 min-1 на 40°C во HPLC растворувач (80:20 метанол:2-пропанол) на колона од ×25 cm. Извршете изократско елуирање во HPLC растворувач за да ја следите апсорпцијата на 275 nm (UQ10), 450 nm (каротеноиди) и 780 nm (BChl) во тек на 1 час. Врвот во хроматограмот од 275 nm на 25,5 минути беше интегриран, кој не содржеше други детектабилни соединенија. Интегрираната површина се користи за пресметување на моларната количина на екстрахиран UQ10 со референца на калибрациската крива пресметана од инјектирањето на чисти стандарди од 0 до 5,8 nmol (Слика S14). Секој примерок беше анализиран во три повторувања, а пријавената грешка одговара на SD на просекот.
Раствор што го содржи комплексот RC-LH1 со максимална апсорпција на Qy од 0,1 беше подготвен со 30 μM редуциран цитохром c2 од коњско срце (Merck, Велика Британија) и 0 до 50 μMUQ2 (Merck, Велика Британија). Три примероци од 1 ml беа подготвени за секоја концентрација на UQ2 и инкубирани преку ноќ во темница на 4°C за да се обезбеди целосна адаптација на темница пред мерењето. Растворот беше внесен во модуларен спектрофотометар OLIS RSM1000 опремен со решетка за пламен/линии од 300 nm, влез од 1,24 mm, среден отвор од 0,12 mm и излез од 0,6 mm. Филтер за пропуст со должина од 600 nm е поставен на влезот од фотоцевката на примерокот и референтната фотомултипликаторска цевка за да се исклучи светлината на побудување. Апсорпцијата беше следена на 550 nm со време на интеграција од 0,15 s. Светлината за возбудување се емитува од 880 nm M880F2 LED (диода што емитува светлина) (Thorlabs Ltd., Велика Британија) преку оптички кабел со интензитет од 90% преку контролер DC2200 (Thorlabs Ltd., Велика Британија) и се емитува кон изворот на светлина под агол од 90°. Мерниот зрак е спротивен на огледалото за да ја врати светлината што првично не била апсорбирана од примерокот. Следете ја апсорпцијата 10 секунди пред осветлувањето од 50 секунди. Потоа, апсорпцијата беше дополнително следена 60 секунди во темница за да се процени степенот до кој хинололот спонтано го редуцира цитохром c23+ (видете ја Слика S8 за сурови податоци).
Податоците беа обработени со прилагодување на линеарна почетна брзина во рок од 0,5 до 10 секунди (во зависност од концентрацијата на UQ2) и пресметување на просекот на брзините на сите три примероци при секоја концентрација на UQ2. Концентрацијата на RC-LH1 пресметана со соодветниот коефициент на екстинкција беше искористена за претворање на брзината во каталитичка ефикасност, прикажана графички во Origin Pro 2019 (OriginLab, САД) и прилагодена на моделот Michaelis-Menten за да се утврдат привидните вредности на Km и Kcat.
За мерења на минлива апсорпција, примерокот RC-LH1 беше разреден на ~2μM во IMAC пуфер што содржи 50 mM натриум аскорбат (Merck, САД) и 0,4 mM тербутин (Merck, САД). Аскорбинската киселина се користи како жртвен донатор на електрони, а терт-бутаклофенот се користи како QB инхибитор за да се осигури дека главниот RC донатор останува редуциран (т.е. не е фотооксидиран) во текот на целиот процес на мерење. Приближно 3 ml примерок се додаваат во прилагодена ротирачка ќелија (со дијаметар од околу 0,1 m, 350 RPM) со должина на оптичка патека од 2 mm за да се осигури дека примерокот во ласерската патека има доволно време за адаптација на темнина помеѓу импулсите на возбудување. Користете ласерски импулси од ~100-fs за да го засилите ласерскиот систем Ti: Sapphire (Spectra Physics, САД) за да го возбудите примерокот на 880 nm со брзина на повторување од 1 kHz (20 nJ за NIR или 100 nJ за Vis). Пред да соберете податоци, изложете го примерокот на побудувачка светлина околу 30 минути. Изложеноста ќе предизвика инактивација на QA (веројатно намалување на QA еднаш или двапати). Но, имајте предвид дека овој процес е реверзибилен бидејќи по долг период на адаптација во темнина, RC полека ќе се врати на QA активност. За мерење на минливи спектри со време на доцнење од -10 до 7000 ps​​ беше користен Helios спектрометар (Ultrafast Systems, САД). Користете го софтверот Surface Xplorer (Ultrafast Systems, САД) за да ги одгрупирате множествата податоци, а потоа да ги споите и стандардизирате. Користете го софтверскиот пакет CarpetView (Light Conversion Ltd., Литванија) за да го користите комбинираниот сет на податоци за да добиете диференцијални спектри поврзани со распаѓање, или користете функција што спојува повеќе експоненти со одговорот на инструментот за да одговара на спектралната еволуција со една бранова должина во Origin (OriginLab, САД).
Како што е споменато погоре (53), беше подготвен фотосинтетски филм што содржи LH1 комплекс на кој му недостасуваат и RC и периферна LH2 антена. Мембраната беше разредена во 20 mM tris (pH 8,0) и потоа ставена во кварцна кивета со оптичка патека од 2 mm. Ласерски пулс од 30nJ беше користен за возбудување на примерокот на 540 nm со време на доцнење од -10 до 7000 ps. Обработете го множеството податоци како што е опишано за примерокот Rps.pal.
Мембраната беше пелетирана со центрифугирање на 150.000 RCF во тек на 2 часа на 4°C, а потоа нејзината апсорпција на 880 nm беше ресуспендирана во 20 mM tris-HCl (pH 8,0) и 200 mM NaCl. Растворете ја мембраната со бавно мешање во 2% (w/v) β-DDM во тек на 1 час во темница на 4°C. Примерокот беше разреден во 100 mM триетиламониум карбонат (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) до концентрација на протеини од 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad анализа). Понатамошна обработка беше извршена според претходно објавениот метод (54), почнувајќи со разредување на 50 μg протеини во вкупно 50 μl TEAB што содржи 1% (w/v) натриум лаурат (Merck, UK). По соникација во траење од 60 секунди, беше редуцирано со 5 mM трис(2-карбоксиетил)фосфин (Merck, UK) на 37°C во траење од 30 минути. За S-алкилација, инкубирајте го примерокот со 10 mM метил S-метилтиометансулфонат (Merck, UK) и додадете го од 200 mM раствор на изопропанол во траење од 10 минути на собна температура. Протеолитичкото варење беше извршено со додавање на 2 μg мешавина од трипсин/ендопротеиназа Lys-C (Promega UK) и инкубирано на 37°C во траење од 3 часа. Лауратниот сурфактант беше екстрахиран со додавање на 50 μl етил ацетат и 10 μl 10% (v/v) трифлуорооцетна киселина од LC степен (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) и вртложење во траење од 60 секунди. Фазното одвојување беше поттикнато со центрифугирање на 15.700 RCF во траење од 5 минути. Според протоколот на производителот, за внимателно аспирирање и десалирање на долната фаза што го содржи пептидот беше употребена спин колона C18 (Thermo Fisher Scientific, Велика Британија). По сушењето со вакуумско центрифугирање, примерокот беше растворен во 0,5% TFA и 3% ацетонитрил, а 500 ng беа анализирани со нанопроточна RP хроматографија поврзана со масена спектрометрија користејќи ги претходно детално опишаните системски параметри.
Користете го MaxQuant v.1.5.3.30 (56) за идентификација и квантификација на протеини за да пребарувате база на податоци за протеоми на Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Податоците за протеомика од масената спектрометрија се депонирани во ProteomeXchange Alliance преку партнерското складиште на PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) под идентификаторот на множеството податоци PXD020402.
За анализа со RPLC поврзан со масена спектрометрија со електроспреј јонизациска маса, комплексот RC-LH1 беше подготвен од Rps од див тип. Користејќи го претходно објавениот метод (16), концентрацијата на протеини произведена во клетките на palustris беше 2 mg ml-1 во 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl и 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad анализа) ) DDM. Според протоколот на производителот, користете комплет за 2D прочистување (GE Healthcare, САД) за да екстрахирате 10 μg протеини со метод на таложење и растворете го талогот во 20 μl 60% (v/v) мравја киселина (FA), 20% (v/v) ацетонитрил и 20% (v/v) вода. Пет микролитри беа анализирани со RPLC (Dionex RSLC) поврзан со масена спектрометрија (Maxis UHR-TOF, Bruker). За сепарација користете колона MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) на 60°C и 100μlmin -1, со градиент од 85% (v/v) растворувач А [0,1% (v/v) FA и 0,02% (V/v) воден раствор на TFA] до 85% (v/v) растворувач Б [0,1% (v/v) FA и 0,02% (v/v) во 90% (v/v) ацетонитрил TFA]. Користејќи стандарден извор на јонизација со електроспреј и стандардни параметри повеќе од 60 минути, масениот спектрометар добива од 100 до 2750 m/z (однос маса-полнеж). Со помош на алатката FindPept на порталот за биоинформатички ресурси ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), мапирајте го масениот спектар на подединиците на комплексот.
Клетките беа одгледувани 72 часа под 100 ml NF-ниска (10μMm-2 s-1), средна (30μMm-2 s-1) или висока (300μMm-2 s-1) светлина. M22 медиум (M22 медиум во кој е изоставен амониум сулфатот, а натриум сукцинатот е заменет со натриум ацетат) во шише од 100 ml со капак на завртка (23). Во пет циклуси од 30 секунди, стаклени зрна од 0,1 микрон беа зрнести со волуменски сооднос од 1:1 за да се лизираат клетките и оладени на мраз 5 минути. Нерастворливата материја, нескршените клетки и стаклените зрна беа отстранети со центрифугирање на 16.000 RCF во текот на 10 минути во микроцентрифуга на маса. Мембраната беше одвоена во ротор од Ti 70.1 со 100.000 RCF во 20 mM tris-HCl (pH 8.0) со градиент од 40/15% (w/w) сахароза во тек на 10 часа.
Како што е опишано во нашата претходна работа, имунодетекција на His ознаката на PufW (16). Накратко, прочистениот јадрен комплекс (11,8 nM) или мембраната што содржи иста концентрација на RC (утврдена со оксидација одземајќи го намалениот спектар на разликата и споредувајќи го оптоварувањето на обоениот гел) во 2x SDS пуфер за полнење (Merck, UK) разреден двапати. Протеините беа одделени на реплика од 12% бис-трис NuPage гел (Thermo Fisher Scientific, UK). Гелот беше обоен со Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) за да се вчита и визуелизира RC-L подгрупата. Протеинот на вториот гел беше префрлен на мембрана со метанол-активиран поливинилиден флуорид (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, UK) за имунотест. PVDF мембраната беше блокирана во 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 и 5% (w/v) обезмастено млеко во прав, а потоа инкубирана со примарното антитело анти-His (во разреден пуфер на антитела [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl и 0,05% (v/v) Tween-20] во 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, САД) во тек на 4 часа. По 3 миење по 5 минути во пуфер со антитела, мембраната беше комбинирана со секундарно антитело против глувче од рен пероксидаза (Sigma-Aldrich, Велика Британија) (разредено 1:10.000 во пуфер со антитела). Инкубирајте за да се овозможи детекција (5 минути по 3 миења во пуфер со антитела) користејќи WESTAR ETA C 2.0 хемилуминисцентен супстрат (Cyanagen, Италија) и Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Велика Британија).
Со цртање на распределбата на интензитетот на секој обоен гел или лента од имунотест, интегрирање на површината под врвот и пресметување на односот на интензитетот на RC-L (обоен гел) и Protein-W (имунотест), во ImageJ (57) Обработете ја сликата. Овие односи беа конвертирани во моларни односи со претпоставка дека односот на RC-L кон protein-W во чистиот примерок RC-LH114-W е 1:1 и нормализирање на целиот збир на податоци соодветно.
За дополнителни материјали за овој напис, видете http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ова е статија со отворен пристап дистрибуирана според условите на лиценцата „Криејтив комонс атрибуција“. Статијата дозволува неограничена употреба, дистрибуција и репродукција во кој било медиум под услов оригиналното дело да е правилно цитирано.
Забелешка: Ве молиме само да ја наведете вашата е-адреса за лицето што го препорачувате на страницата да знае дека сакате да ја види е-поштата и дека не е спам. Нема да ги снимиме е-адресите.
Ова прашање се користи за да се провери дали сте посетител и да се спречи автоматско поднесување на спам.
Дејвид Џ.К. Свејнсбери, Парк Ќиан, Филип Џ. Џексон, Кејтлин М. Фарис, Дариус М. Ниедвјецки, Елизабет Ц. Мартин, Дејвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребека Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Даниел П. Каниф, Марк Џ. Дикман, Дјуи Холтен, Кристин Кирмаер, Ендру Хичкок, Ц. Нил Хантер
Структурата со висока резолуција на комплексот светлосна стапица 1 во реакцискиот центар дава нови сознанија за динамиката на хинонот.
Дејвид Џ.К. Свејнсбери, Парк Ќиан, Филип Џ. Џексон, Кејтлин М. Фарис, Дариус М. Ниедвјецки, Елизабет Ц. Мартин, Дејвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребека Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Даниел П. Каниф, Марк Џ. Дикман, Дјуи Холтен, Кристин Кирмаер, Ендру Хичкок, Ц. Нил Хантер
Структурата со висока резолуција на комплексот светлосна стапица 1 во реакцискиот центар дава нови сознанија за динамиката на хинонот.
©2021 Американско здружение за унапредување на науката. сите права се задржани. AAAS е партнер на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.